3R原则与生物制品行业的未来

（2013中国生物制品年会　稿件）

武汉生物制品研究所有限责任公司　严家新　研究员

5. 狂犬病疫苗效力检定的替代方法

近几年来，为推进3R 原则在生物制品行业中的应用，国际上将特别的关注给予了狂犬病疫苗效价的检测。可能是由于该项检测特别依赖于动物试验、所需的动物数量特别大，而且对动物的伤害和带来的痛苦特别大，因此特别需要尽快找到合适的替代方法。

1）人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会（2011年，美国）

国际生物制品领域权威专业杂志《Biologicals》2012年7月发表了“人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告：科学现状与未来规划”。

这次研讨会于2011年10月在美国爱荷华州Ames国家动物卫生中心举行。来自14个国家的超过80位代表政府、制造商和学术界的科学家参加了研讨会。

目前大多数人用和兽用狂犬病疫苗的效力检定，需要在小鼠中用活狂犬病毒进行攻击实验（NIH法）。参会专家审查了目前在狂犬病疫苗的效力试验中可能减少、优化或替代动物的实验方法的应用和验证现状，对狂犬病疫苗效力检定方法未来的发展方向提出了系统的建议。

i)  鼓励疫苗生产企业进行研究和/或提供历史数据来支持取消目前要求的重复检定。如果以提交生产数据和检定的一致性为条件，监管部门依据单次检定就可发放许可，结果可将使用小鼠的数量减少50％。

制造商应考虑减少试验所用的稀释度的数目，只要这样做并不增加无效检定和进行复检的数量。在进行小鼠效力攻击实验时，最好同时测试多个批次的疫苗，还可同时进行样品稳定性试验。

ii) 　在近期可优先采用一种可替代小鼠攻击实验（NIH法）、同时已经验证可确定效力的实验，如：可采用小鼠血清中和抗体试验(SNT)。与攻击实验相比，SNT也有更好的时间效益比（3周对大于4周）。SNT已经完全标准化，欧洲药典委员会已在2012年4月批准将SNT检测纳入修订的欧洲药典专论0451。

iii) 　在可行的情况下，特别是对于非佐剂疫苗，鼓励制造商考虑在批签发效力实验中直接改用抗原定量测试。

iv) 狂犬病毒G蛋白的天然折叠形式是与病毒颗粒相联的三聚体形式，具有高度的免疫原性。狂犬病疫苗的效力取决于此类构象完整的G蛋白。用能识别这样的G蛋白的单克隆抗体建立的ELISA方法是狂犬病疫苗效力最好的定量方法。如果可溶性G蛋白的存在会干扰免疫相关蛋白的检测，则应该先将其移除或封闭（或两者都包括）。

v)  　不鼓励进一步发展抗体结合试验（ABT）或单向辐射免疫扩散试验（SRID）检测作为效力实验的替代实验，因为它们与小鼠攻击试验的相关性较差，不能区分具有高免疫原性的与病毒颗粒相联的G蛋白与免疫原性较弱的单体G蛋白。然而，SRID分析用于生产过程中检测G蛋白总量可能是有用的。

研讨会提出的建议将有望推动狂犬病疫苗效力试验的替代方法的实施，结果将既能确保人与动物疫苗的安全有效，又能通过优化和减少动物使用而有利于动物的福利。

（据Biologicals (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.biologicals.2012.07.005）

2)  狂犬病疫苗效价检定替代方法专题研讨会　(2012年，法国)

欧洲动物试验替代方法合作组织（European Partnership for Alternative Approaches to AnimalTesting，EPAAA）于2012年10月又在法国阿卡雄（Arcachon）举办了狂犬病疫苗效价检定(NIH法)替代方法专题研讨会。中国食品药品检定研究院曹守春副研究员参加了此次会议。

本次会议的参会人员主要有来自WHO、FDA 和美国CDC等组织、机构和企业负责疫苗质量评价及方法学替代的相关领域专家共计20余人。

法国Noel Tordo教授在关于狂犬病毒及狂犬病疫苗的报告中指出：NIH法目前为WHO推荐的狂犬病疫苗效价测定方法，也是狂犬病疫苗效价测定方法的金标准。 经过对狂犬病疫苗效价测定的多种替代方法的比较，他认为采用ELISA检测糖蛋白抗原含量具有经济、简便和变异系数小等诸多优点，建议优先作为狂犬病疫苗效价测定替代方法进行验证并推广。多位代表一致认为传统的NIH法不仅变异系数在25%—400%之间，而且耗费小鼠量大，实验周期长，给疫苗批签发工作带来很大障碍，因此NIH法替代方法的推进和验证工作意义重大。与会专家一致认为对人用狂犬病疫苗效果的评价采用ELISA检测病毒糖蛋白含量来替代传统的NIH法具有良好的应用前景。

我国是全球人用狂犬病疫苗的生产和使用大国，每年的批签发总量在1200万人份左右。企业对狂犬病疫苗成品检验和国家批签发中效价测定任务十分繁重。国内武汉生物制品研究所有限责任公司已研制出狂犬病毒糖蛋白抗原ELISA检测试剂盒，在国内狂犬病疫苗效价的质量控制中已发挥积极作用。以后应与中国食品药品检定研究院等相关检定部门合作，加速替代方法的推广及验证工作，并建立相应的国家标准。最终目标是建立起国际认可并适用于国内企业产品的ELISA糖蛋白抗原检测方法以替代动物法效价测定。      

(参考：http://www.nicpbp.org.cn/CL0011/3965.html)