A quantitative framework reveals ecological drivers of grassland microbial community assembly in response to warming 

Daliang Ning 1,2, Mengting Yuan 1,3, Linwei Wu 1 , Ya Zhang1 , Xue Guo 1,2, Xishu Zhou1,4, Yunfeng Yang 2, Adam P. Arkin5,6, Mary K. Firestone3,7 & Jizhong Zhou 1,2,7,8✉

摘要

生态问题的核心是找出控制群落组装的驱动因素。虽然一般认为，选择、分散、多样化和漂变是主要的群落组合过程，但确定它们的相对重要性却很有挑战性。本文提出了一种基于二进制系统演化的空模型分析(iCAMP)框架，用于定量地推断群落聚集机制。在模拟群落中， iCAMP显示了很高的精度(0.93–0.99)、精度(0.80–0.94)、灵敏度(0.82–0.94)和特异性(0.95–0.98)，比基于群落的方法高10-160%。在草场微生物群落中， iCAMP的应答增温反应显示出均匀选择(38%)和“漂变”(59%)的主要作用。令人感兴趣的是，升温会随时间而减少“漂移”，并使其主要作用于芽孢杆菌的均匀选择。此外，同质选择与对照相比具有更高的干旱和作物产量相关性。iCAMP为定量微生物的组装过程提供了一个有效而有力的工具，而且对于动植物的生态环境也应该是有用的。

前言

目前已知生命种类最多的微生物几乎生活在地球上每一个可想象的环境中，它们通常形成复杂的群落，其结构、功能、相互作用和动力学对于生态系统的功能和服务都至关重要。但要描述这种复杂的群落，量化其相伴而生的生态过程，并剖析控制生物多样性和群落构成的机制，则具有很大挑战。伴随着高通量宏基因组技术的快速发展，关于群落结构的大量实验数据都能快速获取。但是，由于与探测的特异性、灵敏度、量化、重现性和分类分辨率有关的各种问题，很难对这些海量数据进行分析，以解决群落组合机制等基本的生态问题。

理解群落组成规律是生态学家长期面对的难题之一。根据生态位理论，确定过程，包括环境过滤(例如， pH、温度、湿度和盐度)和各种生物相互作用(例如，竞争、促进、互惠和捕食)在很大程度上控制了物种组成、丰度模式和分布4,5。与此相反，中性理论假定所有物种在生态学上都是相等的，物种动态主要受出生/死亡、物种/灭绝和迁移的随机过程控制[4,6]。经过20世纪6-8年的激烈争论，人们普遍认为确定性过程和随机性过程8-10在本地群落组合过程中同时运行，而关键问题是如何界定它们在控制群落多样性、分布和继承方面的相对重要性3,8-14。Vellend12,15提出了一个概念框架，将生态和中立的群落结构组合观点统一起来，即群落的多样性和动态是由四个高级的整体生态过程控制的：选择、分散、物种形成或多样化和生态漂变15,16。在此之后，我们专门用“生态过程”来描述这些群落组合过程。虽然这个框架最近在微生物生态学领域引起了很大的注意，3,17-19号，但是将这个概念框架转换成定量操作模式更加具有挑战性16-18,20。在缺少定量方法的情况下，对不同自然群落中四种过程的相对重要性的分析大多是定性和主观的，具有很大的不确定性16。为了从统计的角度得到群落装配过程的定量信息，作为一项探索性工作，Stegen开发了一种基于零模型的操作方法[19,20]，以下简称 QPEN (基于整个零模型分析的量化装配过程)。QPEN使用系统发育指数推断选择，因为系统发育距离能够反映某一阈值(所谓的系统发育信号)19,21的生态位差异。这一统计方法是微生物生态学的一大进步，它可以使微生物生态学家获得关于群落组合过程的定量信息。在微生物生态学19,20,22-26和植物生态学27中，对各种生态过程的重要性提供了有价值的见解。但是，一个主要的限制条件是，各种生态过程根据群落中成对更新来估计[19,20]。这种做法也许并不恰当，因为众所周知，不同的生态过程(如自然选择)的作用通常是在较精细的生物组织层面，如基因类型和种群，而不是10、17、18、28、29等群体。某一微生物群落中，某一种群具有较强的选择能力，而其他种群则具有较强的漂变能力。整个群落级别的指标不能用来识别这类差异。类似地，不同的有机体对环境变化的反应也大相径庭。类似地，不同微生物群体的分散力、分散率和敏感度在不同的群体中是不同的。所以，有意义的是，在单个分类群/谱系中，而非在整个群落中，考虑选择和其它生态过程3,17。为了实现这一目标，我们开发了一个通用框架，可以通过基于系统发生 bin的零模型分析(简称为 iCAMP)，根据群落中各个 bin的循环(样本)，定量地推断群落组合机制。利用该方法研究了实验性增温对草地土壤微生物群落形成过程中各种生态过程的影响。研究结果表明， iCAMP为定量研究提供了有力、可靠的工具，在控制微生物群落多样性和发挥生态作用方面具有重要意义。

结果

iCAMP概述为对各种生态过程进行量化，首先将观察到的分类单元按其系统发展关系分成不同的群体(" bins")(图1，补充图1 a)。随后，Raup-Crick测量方法(RC)被用于净相关指数(β NRI)分析，该方法是基于对 beta系统发育多样性的零模型分析，并在分类β多样性的使用上进行了修正(图1，补充图1 b)。对每一个单元，β NRI<-1.96的成对比较分数根据之前应用的阈值，被认为是同一选择百分比，而β NRI>+1.96的成对比较分数则被认为是异构选择百分比。下一步，利用 RC测量分类多样性的方法，从|β NRI|≤1.96分离剩余的成对比较。将 RC<-0.95的成对比较分数作为均化分散百分比处理，而将 RC<+0.95的成对比较分数作为分散限度19,20。残差≤1.96和β NRI||| RC|≤0.95表示漂变、多样化、选择差和/或分散性差的百分比3，为方便起见，以下简称“漂变”19。每一个 bin重复以上分析。然后，通过每个 bin的相对丰度来加权所有 bin中各个过程的分数，并将其汇总以在整个群落水平上估计每个 bin的相对重要性(图1，补充图1 e)。另外， Mantel检验、距离矩阵的多元回归、变异划分(VPA)等各种统计分析都被用来揭示各种过程与不同环境因素之间的联系，从而获得关于群落组成机制的详细知识(图1)。除β NRI和 RC之外， iCAMP还结合了基于零模型分布的直接测试，在本研究中提供了类似于β NRI和 RC的类似结果(补充图17)，当零模型模拟值不符合正态分布时，31应该是更好的选择(请参阅补充说明1)。

在建立真正的群落组装过程方面，缺乏金标准试验，因此，使用模拟群落是评价各种计算方法性能的主要方法，许多其他计算研究32、33中也说明了这一点。所以我们在用在每个生态过程中，模拟模型产生与预定义相关的重要群落(补充图2)。仿真模型考虑了两种环境(L, H)下两个岛屿(A, B)中的四个样本点(LA, LB, HA, HB)，每一个样本点都有六个本地群落(图2 a)。每一个地方群落都由不同种类的物种组成，它们是由漂移、选择和扩散控制的(补充图2 c– e)。采用区域性物种库中三个系统发育信号水平来模拟三种情况：低(Blomberg K=0.15)、中(K=0.9)和高(K=5.5)。每项计划都有15个模拟情景，在这些情景中，每一个过程(选择、分散、漂移)的预期相对重要性从0%到100%(间隔为25%，补充图2 b和补充表1)。利用 iCAMP对不同生态过程的相对重要性进行了评价。绩效通过六项定量和定性指标进行评价：定量准确度和精密度，以及定性准确度、精密度、灵敏度和特异性(在"方法"部分详述，公式(16)–(21))。量化的业绩指标是根据每个过程的期望相对重要性和估计相对重要性之间的差异计算的，而定性的业绩指标是根据对主导过程的正确或错误识别计算的。在模拟社区的基础上，我们优化了 bin算法(补充图3和4)、度量算法(补充图5)和模型零算法(补充图6)，并探索了随机时间和重新抽样分类的效果(补充图7和8)。

比较 iCAMP和其它方法的优缺点。在确定了合适的参数设置之后，比较了 iCAMP和以前报道过的一些模拟群落的性能(图2，补充图9-12)。第一，从五个方面对生态随机性进行量化，其中包括基于中性理论模型的丰度加权中性分类单元百分比(NP)3，根据分类学(tNST)或系统发展指标(pNST)，根据归一化随机率(NST)33，以及基于 QPEN或 iCAMP (均匀分散、分散限制和漂移)的随机过程相对重要性。对于高系统发生信号和中系统发生信号， iCAMP总是表现出最高的定量准确性(0.978–0.997)和精度(0.903–0.930)，而 pNST虽然有类似的准确性(0.924–0.954)，但精度较低(0.658–0.722, p<0.001，图2a-c)。当系统出现信号较少时， iCAMP继续显示最高准确性(0.807)和第二精度(0.770)，而 pNST则显示类似精度(0.723)和第二精度(0.947)。与此相反，在模拟环境(图2 a– c)中， tNST、 NP和 QPEN (<0.57，低到-0.75, p<0.0001)的精度较低。只有 QPEN和 iCAMP能够量化不同生态过程的相对重要性。所以我们比较他们的表现。iCAMP的平均准确度较高(0.93–0.99对0.81–0.97，提高9.9%)，精确度较高(0.82–0.94对0.33–0.52,120.2%)，敏感性较高(0.83–0.94对0.54–0.58,61.1%)，特异性较强(0.96–0.98对0.87–0.88，增长10.6%)。在 iCAMP中，系统发生信号的设置也对性能产生重要影响。在系统发生信号由低/中高(图2 i，补充图9 k, l)时， iCAMP的精确度和特异性仍然很高(>0.92)，没有显著性变化(p>0.20)，但 iCAMP的精确度和灵敏度从0.80-0.82提高到0.90-0.94。与此相反，更高的系统发生信号能够提高 QPEN的性能。另外， iCAMP在确定 bin时存在不确定性(补充图10和11，见补充说明2)。它们的性能在不同的生态过程中有很大差别(图2 d– h，补充图12)。对于中高系统出现信号时的模拟群体， iCAMP的各项性能指标均高于0.78 (补充图12)，表明与 QPEN相比有很大改善，特别是在估计均质和异质选择方面。但 iCAMP对均质的敏感性较低(低至0.17)，因为系统发生信号低(补充图12)，但仍高于 QPEN (P<0.04)(p<0.05)。研究结果表明，生态位较低的系统发育信号，限制了系统发育信号的推断选择能力。可能有部分原因，在 iCAMP中，用系统发展指标来推断选择，但不能完全克服。然而， iCAMP在所有过程中的定量性能在所有过程中都保持相对较高的水平，其定量精度为0.71–1.00 (比 QPEN平均高出129%)，这表明 iCAMP能够显著改进群落装配过程的定量估计。

温度升高对草原菌群组装的影响将 iCAMP技术应用于实验升温条件下草原土壤细菌群落的研究，着重于处理空间周转问题，以验证 iCAMP技术在实际研究中的有效性。据 iCAMP分析，均质选择和细菌群落组合的漂变较其他方法更重要，其相对重要性平均分别为37.0–38.5%和58.3–59.9%(图3 a, b)。温度升高会显著改变不同过程的相对重要性(p<0.01, permutational ANOVA分析)。因为对其它方法的估计相对重要性较低(<3.4%)，所以在以后的分析中，我们将重点讨论温度升高对均质选择和漂变的影响。总的来说，温度的升高降低了漂变的相对重要性，增加了均匀选择。可见每年都有明显变化(图3 c, d)。一年内，温度升高的群落出现明显的高漂变率(Cohen d=2.9, p=0.001)，但是，与对照组相比，温度升高的群落出现高漂变率，均质选择较低(Cohen d=-2.7, p=0.001)，这表明在群落组装初期，温度升高增加了随机过程。两年温度升高的差别变得很小。三至五年间，群落温度升高的比例更大。均匀选择(Cohen d=0.6–1.7)和低度漂变(Cohen d=-0.8至-1.3)表明温度逐渐升高会给土壤细菌带来选择压力. QPEN还用来量化生态过程。QPEN的结果表明，虽然没有显著性，但均质选择占优势(>73%)，在升温时的相对重要性(83.3%)高于对照(73.3%，补充图13 a, b)(73.3%)。根据 QPEN的说法，暖化漂变和非均质选择在所有年份中分别是0.0%和0.0%，在所有年份均化分散，在某些年份则是100%均质选择(图13 c, d)。在各种生态系统中，10、11、13、14、35，包括沙漠28和酸性土壤25，都广泛报道了随机过程的重要作用，这似乎是不合理的（其它研究与作者的结果有出入）。

任意确定的细菌组合。以 iCAMP和 QPEN为基础的零模型的基本原理是：弥散限制，均质弥散和漂变的分数在很大程度上是随机的。它所估算的相对重要性之和可以用来估算群落装配的随机程度。在对照组，根据 iCAMP的结果，随机过程的相对重要性是62.6%，当温度升高时则是61.3%(图14)。与之相比， QPEN估计在控制条件下随机过程的相对重要性为26.7%，在温度升高时为16.7%。估计结果远低于其他方法(见图14)。比如，变异划分分析(VPA)表明，很大一部分群落(68.4%)的变异无法用所有已测环境变量解释34。在增温时， tNST和 pNST平均为48.8%，对照时为52.3%，不同年份 NP的增温和控制从74%上升到79%(见图14)。与 QPEN相比， VPA、 NST和 NP似乎更符合 iCAMP的显示结果。除 tNST外，所有方法均无显著差异(p>0.10)，变暖和对照之间平均5年的随机变化(p<0.05，补充图14)。但在第三到第五年， tNST和 iCAMP显示出增温在随机过程中明显下降(p<0.05)，而 pNST和 NP在增温过程中则略有下降(效应量较小)，尽管这并不重要(p>0.10)。而 QPEN则略有变化，但随机性增加不明显。和前面的分析一致，有多种方法支持草原土壤细菌群落的组装在随机过程中起着更大的作用，但增温3年后，这种随机作用降低了。

在不同系统中发展群体的组合机制iCAMP相对于 QPEN和其他方法而言，能够提供关于不同生态系统的相对重要性的单一信息谱系(bin)过程。为了实现这一点，观测到的18,123个 OTU被划分为658个系统发生区，然后按图1所示分别进行分析。结果表明，59个 bin为同质选择(bin9%，相对丰富度33%，见图4 a)。其中， Bacillales为两大类 bin (bin1，均质选择合计26.7%控制的 bin数量), Verrucomicrobia为硬菌素和 Spartobacteria (Bin 2,18.8%)(图4 b，补充图15 a)。与此相反，漂流占据了598个 bin (bin数量的91%，相对丰富度为67%，图4 a)，主要是 Alphaproteobacteria细菌(占漂变控制 bin总数的22.2%)和 Phylum放线菌(23.5%，补充图15 a)。为研究不同谱系对升温的反应，我们进一步确定了在第三至第五年由细菌引起的升温所导致的均质选择和漂移变化(图4 c, d)。结果显示， Firmicutes在58.2%的升温情况下，使选择均匀度提高(见图15 b)。均质选择控制了最丰富的沙门氏菌箱(Bin 1, Bacillales，平均74.8%)(补充图15 c)。在严重旱灾3年后，气温升高时，坚硬的地皮明显多于对照(图15 c)。相反，与图1相比，升温幅度的下降是由五个门(变形菌、疣状微生物、拟杆菌、浮游杆菌和酸性细菌，图4 c，补充图15 b)中许多箱体的类似负反应引起的。举例来说，根瘤菌属的4-丙酸杆菌相对丰度较低，减少了在变暖条件下漂移的相对重要性，特别是在晚期3年(补充图15 d)。在三至五年级之间，温度升高时，共有27个垃圾桶相对丰度较高(Wilcoxon p<0.05, Cohend>0.5)，高于对照组(Wilcoxon p<0.05)。但其中81%(22个垃圾桶)主要受漂流控制，而其中两个则从对漂流的控制转为对变暖情况下的均一选择。研究表明， bin不同类型的组装机制对升温有很大的影响，如果没有 bin级别的机械信息，就可能产生误解。

影响生态过程的环境因素

通过Mantel法和 MRM法进一步研究了各种生态过程中环境因子的作用。因为其它工艺(异质选择，均质分散和分散限制)不太重要，所以我们主要关注均质选择和漂移。总体而言，这两种过程都与环境中的水、温度和植物之间存在明显的联系(图5，补充图16，补充表2和3)。这一关系因变暖而大大改变(图5，补充图16)。同质选择在控制下表现出最强的相关性。碳4生物量差异与植物富集程度之间的关系(MantelR2>0.33, p<0.01，图5 a，补充表2)，以及与干旱、降水和水分之间的关系(R2>0.3, p<0.01)。相反，同质选择与干旱和降水量最相关(R2=0.52-0.57, p<0.1)，在加温条件下最相关，C-4、全株生物量和土壤温度(R2=0.32, p<0.1)最相关(图5 a)。令人感兴趣的是，当变暖与受控C-4生物量的差异非常相关时，干旱或任何其他影响都是由其他因素控制的(pMantel，补充表3)。在考虑多个因素可能显著相关的情况下，进一步利用 MRM确定不同环境因素对均质贡献的选择。实验结果表明， MRM模型能够解释在变热条件下很大比例的均质图选择(R2=0.94, p<0.001，图5 b)和控制(R 2=0.86, p<0.001，图5 c)。解释均匀选择的最重要变量是加利福尼亚的土壤温度。气温上升时的取样月份(b=0.92, p<0.001，图5 b)，以及对照条件下(b=-1.2, p<0.001，图5 c)的图间差异。与此同时，一些与水和植物有关的变量也显示出显著(虽然较小)的影响(| b|>0.16, p<0.1)，其中包括植物总生物量、干旱和变暖时的水分含量(图5 b)、植物丰富度、C-4生物量、降水和对照中的水分含量(图5 c)。这说明，土壤温度、植物生产力和干旱分别可以更有效地解释变暖条件下的均匀图形变化。迁移与各种环境因素，如 mantel (补充图16 a，补充表2)和 pmantel (补充表3)有类似的关系。精通程度的 MRM模型显示，不同植物在土壤中的总碳和氮量差异和相对降水量对漂移的强烈影响(| b|>0.36, p<0.06，补充图16 c)。随着气温升高，漂流的三个最重要的变量包括植物、土壤温度和干旱(| b|=0.34-0.66, p<0.005，补充图16 b)。总体而言，这些结果表明，影响均质选择和温度变化的环境因子在增温条件下比对照组更为相似。