精读《Expression of a Chimeric Allergen with High Rare Codons Content in Codon Bias-Adjusted Escherichia coli: Escherichia coli BL21 (DE3)-Codon Plus RIL as an Efficient Host 》

             2016    --作者：Hamid Reza Nouri1 • Ahmad Karkhah2 • Abdolreza Varasteh3 • Mojtaba Sankian

大肠杆菌作为一种众所周知的表达系统，虽然有许多优点，但是这种表达系统存在许多问题，包括高分子量蛋白质的低表达和不溶性聚集体的形成[1]，大肠杆菌另一个重要的问题是存在密码子偏倚的现象[2]，即编码同一氨基酸的不同密码子的非平均使用现象。大肠杆菌中的稀有密码子包括AGG/AGA/CGG(精氨酸)、AUA(异亮氨酸)、CUA(亮氨酸)、CCC(脯氨酸)和GGA(甘氨酸)。因此，具有高稀有密码子含量的异源蛋白的表达与期望蛋白的表达效率或溶解度的并发症有关。目前解决密码子偏倚的策略有例如通过无声诱变来优化外源编码序列的密码子，或者通过宿主修饰来增加表达不足的tRNA的可用性。

如今，可用于表达具有稀有密码子或二硫键的异源蛋白质的几株大肠杆菌菌株可以通过购买获得。大肠杆菌E. coli BL21 Codon Plus（DE3-RIL），Rosetta（DE3）和Origami是最知名的密码子偏倚调整的大肠杆菌菌株。在经修饰的大肠杆菌菌株中，BL21 Codon Plus（DE3-RIL）能够表达具有高水平AGG/AGA（精氨酸），AUA（异亮氨酸）和CUA（亮氨酸）密码子的蛋白质。另外，遗传修饰的Rosetta（DE3）菌株携带有与AGG/AGA（精氨酸），CGG（精氨酸），AUA（异亮氨酸），CUA（亮氨酸），CCC（脯氨酸）和GGA（甘氨酸）相关的tRNA。此外，Origami是在硫氧还蛋白还原酶（trxB）和谷胱甘肽还原酶（gor）中具有双突变体的菌株，其可能提供异源蛋白质的正确折叠。与其他密码子偏倚调整的菌株相比，大肠杆菌BL21（DE3）对密码子偏倚现象没有任何操纵[3]。

本文通过选择合适的宿主重组表达C.album花粉中的过敏原 确定哪种密码子偏倚调节的大肠杆菌菌株足以表达嵌合过敏原。利用PCR的方法将Che a1，Che a2和Che a3重组为嵌合DNA，并连接在载体pET21b+质粒上。将构建的重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21（DE3），BL21密码子加（DE3）RIL，Rosetta和Origami中，经IPTG诱导进行重组蛋白的表达纯化。还通过Western印迹分析了从修饰的大肠杆菌中纯化的每种嵌合变应原的IgE特异性免疫反应性。结果表明，大肠杆菌DE3-RIL和Rosetta在可溶性部分表达嵌合变应原。相反，BL21（DE3）和Origami菌株在包涵体部分中表达这种变应原。BL21 Codon Plus(DE3)RIL产生具有46kD的完整形式的嵌合变应原，而Rosetta株(图3c)产生重组蛋白和一些低分子量。获得的结果显示具有高含量稀有密码子的嵌合变应原在BL21（DE3）-Codon Plus-pRIL的可溶相中以高水平表达。

（泳道1和2分别显示了可溶性和包涵体部分中嵌合变应原的表达。 泳道3显示通过Ni-NTA层析纯化后的重组蛋白。）

参考文献：

[1]. Sahdev S, Khattar SK, Saini KS (2008) Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem 307(1–2):249–264. doi:10.1007/s11010-007-9603-6

[2]. Kurland CG (1991) Codon bias and gene expression. FEBS Lett 285(2):165–169

[3]. Sorensen HP, Mortensen KK (2005) Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol 115(2):113–128. doi:10.1016/j.jbiotec.2004.08.004

附一个查密码子频率的地址：codon usage table