随机光学重构显微镜由华裔学者庄小威发明，想必更为大家所熟悉，光控荧光小分子由庄小威实验室的研究生马克﹒贝茨(Mark Bates)2004年首先发现，实际上可以用激光开光荧光小分子在其它实验室如Taekjip Ha等也曾被观察到过，但并没有引起大家的重视。但马克﹒贝茨的发现得到了小威的重视，随后她根据这一发现设计出随机光学重构显微镜。庄小威的早期科研工作主要是单分子荧光共振能量转移，然而随机光学重构显微术的发明使她认识到了成像技术对生物学研究的重大意义，因此现在庄小威已经将实验室的研究方向完全转到了超分辩率成像领域。

迈阿密州奥罗诺市的萨姆﹒赫斯同样在2006年发明了荧光光活化定位显微术，在原理上与STORM和PALM相同。细胞中有成千上万个荧光分子，如果我们全部激发细胞中的荧光分子，荧光分子因衍射造成的大于分子本身大小的艾雷光盘(airy disk)会互相重叠，所以我们无法分别单个的荧光分子。如果我们能随机的激活一小部分荧光，将这些分子确定之后，我们再激活另一小部分分子，在若干个周期后将图像叠加重构三维图像，这样分辩率可以达到几十个纳米。

厚样品的三维成像始终是光学显微镜领域的难题，断层扫瞄不能用于活样品，薄片光显微镜就可以对厚组织如斑马鱼胚胎等三维快速活体成像。薄片光的思想实际上在1903年的时候就提出了，然而直到1993年Voie才用薄片光的原理开发了正交面荧光光学切片显微镜(Orthogonal plan fluorescence optical sectioning)，样品由薄片光扫瞄成像。2004年Stelzer发明了选择薄片光显微镜(Selective Plane Illumination Microscopy, SPIM),SPIM可以三维高分辩率高穿透深度成像， 由于薄片光显微镜只激发成像平面的标本，和共聚焦相比，对整体标本的光毒性小，光漂白低，适合长时称活体成像。2008年Stelzer改进了SPIM，改进版的SPIM可以对斑马鱼胚胎进行24小时成像并追逐胚胎发育过程中的细胞位移和分裂。

超分辩率显微镜是体内(in vivo)研究的主要手段，然而现代生物学研究是体内与体外(in vitro)研究的结合，体外研究主要以生物化学与生物物理两大学科为主要手段，当然这两个学科也可以从事体内的研究。生物物理学以几大核心技术为支撑：X-射线衍射，低温电镜，质谱，核磁共振(固态，液态和磁共振成像)，单分子生物物理。如果大家参加国际上大型的生物物理学会议，就会发现以上几个方向占所有学术报告的95%以上。单分子技术是近年的新兴领域：包括单分子FRET，光镊，磁镊，原子力显微镜，纳米孔等。单分子技术主要研究体外纯化的蛋白质或其它生物大分子的相互作用，动态和分子功能。单分子技术的发展只是最近几十年的事情。

  英国科学家道尔顿和意大利化学家阿莫迪欧·阿伏伽德罗先后在1803和1811年提出原子和分子学说后，直到1911年法国科学家佩兰通过布朗运动实验才第一次证明了分子的存在1。在那时佩兰就曾试图通过肉眼在显微镜下观测单个荧光分子，但是由于受限于但是得实验条件的（人眼的灵敏度，光源，显微镜以及各种光学元器件）该实验并未成功。要实现对单个分子的光学检测，首先分子的荧光信号必须足够强能够被探测到，而且分子周围的背景光必须足够弱使得分子与背景有足够的对比度。在上世纪70年代，人们成功实现了在气相中对单个原子的检测。当原子经过激光束时会被激发而发射共振荧光，通过检测该荧光信号而实现单个原子的检测。在气相中，原子周围的是真空状态，所以在没有原子时基本没有背景光，当一个原子进入激发光区域被激发后，只要探测装置足够灵敏即可以实现单个原子的探测。但是该技术不不能直接应用到固相或液相中的单分子检测。在固相或液相中目标分子往往被大量溶剂或其它介质分子包围（在显微镜聚焦光斑的体积内约有109个溶剂分子），这些分子都会对激发光进行散射（瑞利散射），从而造成非常强的背景光，而目标分子或原子往往被淹没在这些散射光中而无法被探测到。因此在固相和液相体系中必须通过分子的荧光发射，结合适当的滤光片选择性的对目标分子的荧光进行探测才可能实现单个分子的探测。当然除了瑞利散射外，溶剂或介质分子往往会后拉曼散射，虽然相对于荧光来说拉曼散射的强度较低，但是由于分子数量上的巨大差距，拉曼散射也为单分子荧光检测造成一定困难，因此即使在现在的技术条件下只有量子产率较高的荧光分子才可以实现单分子检测。

直到80年代末，随着探测设备灵敏度的提高，激光技术以及各种光学元件的发展，通过共聚焦显微镜已经可以将激光束聚焦于亚微米尺度，这使得背景杂散光和杂质的影响大大减弱，终于W.E. Morner等人第一次在液氦温度下探测到单个分子对激光束的影响，从而第一次实现在固相中单个分子的光学检测4。第二年，M. Orrit等人同样在液氦温度下通过探测分子的荧光第一次实现了单分子荧光检测5，也开辟了单分子荧光光谱技术的崭新领域6。直到1993年Betzig等人利用近场光学显微镜，让我们真正看到了单个的荧光分子1。1995和1996年Funatsu和Macklin分别实现了全反射和共聚焦荧光显微镜进行远场单分子成像，使单分子检测变得更加容易和普适1,2。

在单分子荧光显微镜领域，华裔学者美国科学院院士谢晓亮也做出了重要贡献。在Morner和Orrit等人后，谢晓亮最早提出了常温下单分子光谱设想，并把它的生物学应用提上日程。谢晓亮是一个敢于大胆设想，善于把不可能东西变为可能的著名科学家。谢晓亮还对非荧光标记单分子技术做出了贡献，非荧光标记单分子技术难度更大，限制性因素很多，距离广泛应用还很远。谢晓亮最早开发了相干反斯托克斯拉曼散射显微镜(coherent anti-Stokes Raman spectroscopy，CARS Microscopy)，CARS可以在非荧光标记的情况下对分子的振动频率高灵敏检测，主要用来对细胞膜的脂类分子进行研究。2008年他们又推出了受激拉曼散射显微镜(stimulated Raman scattering microscopy，SRS Microscopy），SRS可以研究活细胞上饱和和不饱和脂类分子的分部，并研究他们在膜上的扩散.

光镊技术是用高度聚焦的强光在三维空间固定和移动介电颗粒。在神化和科幻电影中，我们可以看到物体在不与任何物体接触的情况下可以在空中移动，单分子光镊就可以做同样的事情。理论上如果光强足够大，我们可以在空中固定和移动宏观物体。1970年美国贝尔实验室的阿瑟﹒埃什肯(Arthur Ashkin)首先发现了光散射和光强梯度可以对微观粒子产生作用力，光子的动量可以转到微观粒子。1986年华裔学者朱棣文(Steven Chu)第一次用光镊的原理冷却和固定中性原子，因此获1997年的诺贝尔奖物理学奖，朱棣文首次证明了用光镊对单分子研究的可能。在1980年左右，Ashkin用光镊对烟草花叶病毒进行了研究，这是光镊最早在生物学中的应用。10年后的90年代美国加州大学柏克莱分校的阿根廷裔学者卡洛斯﹒布斯塔曼特(Carlos Bustamante)和斯坦福大学的詹姆士﹒斯普迪赫(James Spudich)与史蒂文﹒步洛克(Steven Block)将光镊成功的用于研究分子马达，发展了光镊在生物学中的应用研究。

回眸历史，那些引路人勇敢铿锵的脚步声犹如在耳。在显微镜技术发展500年的短暂历史中，西方世界的学者做出了更加重要的工作，各种历史原因使我们中国没有在这里留下浓重的痕迹。谨以此书为念，希望未来若干年更多有创造力的中国人在显微镜领域创造辉煌。