三维成像需要光学显微镜具有断层扫描的功能，这就需要分辩聚焦和非聚焦背景光。常见的荧光光学断层是共聚焦和双光子，但人们始终在探索新的手段，可以高速，广视场，与长时间成像。这里有两个技术：平面照射和结构照射。用过显微镜的人都知道，当样品不聚焦时成像会模糊不可分辩，这是成像中的头疼问题，尤其是对厚样品成像，这是只有一小部分样品聚焦，而不在聚焦的部分就会模糊的背景信号。普通的荧光显微镜是没有扫描功能的，这里有两个策略可以考虑，第一个是比较直接就是不产生非聚焦的光信号，没有非聚焦光当然就没有背景了。二是常有的方法即剔除非聚焦面来的光，不光在探测之前还是之后，把它从图像中去除，二者各有所长。不产生非焦平面光的是双光子，荧光信号只在聚焦面上由于光与物质非线性相互左右很小的体内内产生，因此非聚焦本质上就没有。第二中方法的代表是共聚焦激光扫描显微镜，这里光与物质作用是线性的，荧光信号在聚焦面的上下都有，但随后非聚焦面来得光被小孔滤过。有人对共聚焦和双光子也称作单光子和双光子扫描显微镜。

平面照射显微镜就是用超薄光从样品侧面照射，激发了样品的一个二维断层面。发射的荧光从样品的上面或下面成像，探测器放置在垂直于照射平面的光轴上。在理想情况下，照射平面的上面和下面是不会发出荧光的，意味着平面照射显微镜提供了内在光学扫描功能基于不产生非聚焦荧光的原理。这个思想起源于1903年，当时平面照射通过光散射成像来研究胶体溶液。直到最近荧光平面显微镜在生物成像中逐渐发展。目前有两种平面照射显微镜，两个都是宽场成像并有数字照相机，但照射的策略不同。在宽场照明策略中，照明光平面是静止的并散布在整个视场。在线扫描照明策略中，光平面是通过侧面小直径光束的全视场扫描形成，在曝光过程中形成平面。在讨论优缺点时，重温我们熟知的激光扫描显微镜中的点扫描照明策略，激光照射到样品的上面并聚焦在一个点上，然后在二维平面侧向扫描。激光扫描显微镜中的信号探测用是采用单元素探测器，一般是光电二级管或血崩光电二级管。如此，激光扫描显微镜的象素大小，就是图像上连续扫描点间的距离，可以选择任意值。

   蓝色是激发光部分，绿色是采集光路。图(e)到(f)就是Zeiss公司=商品化的SPIM的原理。