工程梭菌释放氢气促进创面愈合

厌氧水凝胶局部施用丁酸梭菌通过选择性抑菌与活性氧清除促进糖尿病创面愈合

糖尿病溃疡是糖尿病严重且可能危及生命的慢性并发症[1,2,3]，其中糖尿病足溃疡最为常见，因其难以愈合、易感染，常引发组织坏疽[4,5]，已成为临床上非外伤性截肢的首要原因[6,7]。大量研究表明，糖尿病创面中过量活性氧（ROS）的累积是其难以愈合的重要原因[8]。糖尿病患者高血糖会引发非酶糖基化反应，该过程会释放大量ROS[9,10]。糖尿病创面中过量的ROS不仅会诱导促炎因子上调，引发创面强烈炎症反应，阻碍创面从炎症期向增殖期和重塑期过渡[8,11]，还会造成氧化损伤，影响内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞功能，抑制血管新生、胶原沉积与再上皮化，导致糖尿病创面愈合困难[12,13,14]。同时，开放性创面的慢性化与高糖微环境使其极易发生细菌感染[15]，严重时可导致创面愈合延迟、截肢及死亡风险升高。因此，清除ROS与预防细菌感染是实现糖尿病溃疡创面有效愈合的关键[16]。

目前，抗生素、抗菌材料及光热抗菌剂已被用于抑制糖尿病创面细菌感染以促进愈合[17]；非甾体抗炎药、人工纳米酶则被用于创面愈合过程中的ROS清除[18,19]。这些治疗手段均取得了一定疗效，证实抑菌或清除ROS确实可加速糖尿病创面愈合。但随着研究深入，为进一步提升愈合效果，对细菌清除与ROS去除提出了更精细化的标准。

首先，皮肤表面存在多种有益菌，对创面愈合至关重要。有研究表明，部分共生菌可刺激免疫系统产生抗炎细胞因子，促进创面愈合[20]。而传统抗菌方法在清除有害病原菌的同时，也会无差别损伤皮肤表面有益菌，进而阻碍创面愈合。

其次，ROS包含多种类型，如超氧阴离子（O₂⁻•）、羟基自由基（•OH）、过氧亚硝基阴离子（ONOO⁻）、一氧化氮（NO•）、过氧化氢（H₂O₂）等[21]。现有ROS清除手段多为非特异性清除所有ROS，可能破坏机体氧化–抗氧化平衡[22]。

事实上，低浓度O₂⁻•和H₂O₂是重要的信号调控分子，参与多种信号转导通路，调控细胞凋亡、增殖与分化等关键生命过程[23,24]；NO•作为神经递质，在血管舒张中发挥重要作用[25]，这些均有利于创面修复。但与其他ROS相比，•OH和ONOO⁻反应活性更强，其中•OH被认为是氧化性最强的活性氧，可无差别攻击核酸、脂质与蛋白质[26]。二者均具有高毒性，会造成组织损伤、延缓创面愈合。因此，选择性抑制有害菌、选择性清除•OH与ONOO⁻成为糖尿病溃疡治疗研究提出的新要求。然而，同时实现这两种“选择性”目标尚无报道，是一项兼具挑战性与开创性的工作。

文献报道，氢气（H₂）可选择性清除•OH和ONOO⁻[8,22]。自2007年Ohsawa等发现H₂可通过中和•OH减轻脑缺血再灌注损伤[22]以来，氢气已成为前沿的治疗性医用气体。H₂可选择性清除•OH和ONOO⁻这两种高毒性自由基，保护细胞与组织免受氧化应激与炎症损伤，其抗炎、抗氧化、抗凋亡作用已得到广泛认可[27]。

部分益生菌为维持自身生存，可通过代谢产生游离脂肪酸、细菌素等抗菌物质，有效抑制竞争菌生长，对有害菌发挥选择性杀菌作用[28,29,30]。近期，有研究将乳酸菌载入水凝胶用于感染性皮肤创面治疗[28]，结果显示载乳酸菌水凝胶可有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等病原菌，对金黄色葡萄球菌感染的小鼠皮肤创面具有更佳的愈合效果。

受此启发，本研究聚焦于丁酸梭菌——该菌可在厌氧环境下高效产氢并抑制病原菌生长，有望同时实现上述两种“选择性”目标，在糖尿病溃疡创面愈合中极具应用前景，但目前尚无相关研究报道。主要原因在于：丁酸梭菌为厌氧菌，皮肤外用时常氧环境无法维持其生理活性，难以发挥产氢与抗菌功能。

为解决这一问题，本研究提出构建一种新型厌氧水凝胶，为内部提供无氧环境，并以此为载体搭载丁酸梭菌，满足其厌氧生长需求（示意图1中简写为C. butyricum@Anaerobic-Gel）。选用从香荚兰豆中提取的天然醛类化合物香兰素（Van）作为耗氧底物，其具有良好生物相容性、溶解性、反应显色性与反应可控性[31,32]。值得注意的是，漆酶与香兰素已被用于构建厌氧水凝胶，作为脂肪间充质干细胞的载体，实现干细胞在体内的靶向递送与驻留[33]。本研究中，将香兰素与醛基改性海藻酸钠（ALG-CHO）偶联，得到Van-ALG-CHO，再与含有丁酸梭菌、漆酶、羧甲基壳聚糖（CMCS）的溶液混合。通过醛基（–CHO）与氨基（–NH₂）的希夫碱反应，Van-ALG-CHO与CMCS交联形成水凝胶，将丁酸梭菌与漆酶共同包埋于体系中，成功构建C. butyricum@Anaerobic-Gel（示意图1A）。在该体系内，香兰素与漆酶发生耗氧反应，有效消耗水凝胶基质中的溶解氧，在内部形成厌氧微环境（示意图1A）。即使在常氧皮肤条件下局部施用，水凝胶内部的丁酸梭菌仍可处于厌氧状态，维持生理活性，同步发挥产氢与抗菌作用。因此，C. butyricum@Anaerobic-Gel可同时满足“选择性抑菌+选择性清除ROS”的要求，在糖尿病创面愈合中展现出良好应用潜力（示意图1B）。本研究通过构建可维持厌氧微环境的递送平台，有望解决丁酸梭菌在皮肤常氧环境下局部应用的瓶颈问题，不仅为丁酸梭菌用于糖尿病溃疡治疗奠定基础，也为其他厌氧益生菌在常氧环境下的应用提供参考。

摘要

在不影响皮肤共生益生菌的前提下选择性抑制有害菌，以及选择性清除羟基自由基（•OH）、过氧亚硝基阴离子（ONOO⁻）等高毒性活性氧（ROS），是糖尿病溃疡创面更精准治疗的新要求。实现其中任一目标均颇具挑战，而同时实现两者尚无相关报道。丁酸梭菌（*Clostridium butyricum*，C. butyricum）本身具有选择性抗菌作用，且可产生氢气，能特异性清除•OH和ONOO⁻，在糖尿病创面治疗中展现出巨大潜力。然而，作为厌氧菌，其厌氧特性限制了其在皮肤常氧环境下的局部应用。为解决这一问题，本研究构建了一种新型水凝胶，通过香兰素与漆酶的耗氧反应在水凝胶内部形成厌氧微环境。该水凝胶作为载体，可确保包埋的丁酸梭菌在常氧条件下保持活性，从而发挥选择性抑菌与选择性清除ROS的双重功效。体内实验证实，载丁酸梭菌水凝胶可显著促进糖尿病创面愈合。本研究为丁酸梭菌局部应用于创面治疗提供了新思路。