撰文 | 王蕊 夏志蕊 王颖雯 朱丽君 刘爽 曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

线粒体传统上被视为独立的细胞器，主要负责能量生产。然而，越来越多的证据表明，线粒体是能够适应代谢变化和细胞应激的动态细胞器。因此，线粒体通过与细胞核及其他细胞器的通讯来维持细胞稳态。

鉴于线粒体的基础作用，其障碍(尤其是氧化磷酸化(OXPHOS)缺陷)与衰老和多种疾病相关并不令人惊讶。线粒体应激会触发核响应，通过改变基因表达来抵抗细胞损伤。在哺乳动物细胞中，线粒体整合应激反应(mitoISR)是由OXPHOS扰乱后最早激活的转录程序之一。这一反应会导致代谢重编程，从而维持或破坏组织稳态(小编注：线粒体未折叠蛋白反应是细胞应对线粒体损伤或功能障碍的一系列复杂调控机制，通过感知线粒体蛋白折叠压力，激活核转录重编程，上调分子伴侣和蛋白酶表达以恢复线粒体功能。线粒体未折叠蛋白反应的激活涉及到多条线粒体细胞核通讯途径，其中，线粒体整合应激反应是指线粒体通过PERK或HRI激酶磷酸化eIF2α，抑制全局蛋白翻译的同时选择性激活ATF4翻译，进而上调线粒体未折叠蛋白反应)。

拓展阅读

氧化磷酸化(OXPHOS)

OXPHOS是细胞代谢的中心，它由四种电子传递链酶复合物I-IV和两种移动电子载体辅酶Q(CoQ)和细胞色素c组成，负责从营养物质或储存化合物的上游分解代谢途径产生的NADH和FADH₂中获取还原当量，并将其转移到O₂中，从而形成H₂O。在此过程中，来自糖酵解或脂肪酸代谢的乙酰CoA进入TCA循环，产生NADH和FADH₂，而电子转移通过复合物I、III、IV以及细胞色素c所释放的能量促进质子穿过线粒体内膜，复合物II则主要执行氧化还原功能。质子的膜内外不对称梯度形成了“质子动力”，被ATP合酶(复合物V)所利用，促进ADP和无机磷酸盐生成ATP。

线粒体应激的生理后果（特别是在组织特异性背景下）尚未被完全阐明，白色和棕色脂肪组织（WAT和BAT）高度依赖线粒体功能，并表现出显著的代谢可塑性，以满足生理需求。在WAT中，线粒体通过甘油三酯积累和脂解作用调节能量储存和动员。相比之下，富含线粒体的BAT则通过解偶联蛋白1（UCP1）驱动产热作用，将能量以热能形式释放。这一过程对新生儿和寒冷诱导的温度调节至关重要。这两种组织都表现出代谢可塑性：WAT在寒冷、β-肾上腺素能刺激、运动或禁食条件下会发生棕色化，增加线粒体含量和解偶联作用；相反，BAT在热中性环境、衰老或营养过剩条件下会发生白色化，导致脂质积累和产热功能丧失。

长期暴露于热中性环境（约30°C）会通过E3泛素-蛋白连接酶PARKIN介导的线粒体自噬和碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）驱动的脂肪酸合成转变诱导BAT白色化。肥胖、高脂饮食和衰老等因素同样会促进BAT白色化，其特征是脂质积累、血管生成减少和产热功能受损。脂解酶和氧化酶(如ATGL和CPT2)或关键转录调节因子(如PGC-1和PRDM16)的遗传缺失，会破坏BAT分化和线粒体生物合成，导致白色化。无论诱因如何，BAT白色化的共同标志都是脂滴扩张伴随线粒体质量或功能降低。此外，线粒体融合蛋白(MFN2和OPA1)或线粒体DNA(mtDNA)维持蛋白(TFAM)的缺失也会引发BAT白色化。这些发现凸显了OXPHOS完整性在BAT稳态中的核心作用。然而将线粒体功能与BAT稳态联系起来的潜在机制仍未完全阐明。近期，一篇发表在Nature Metabolism上的名为“2-hydroxyglutarate mediates whitening of brown adipocytes coupled to nuclear softening upon mitochondrial dysfunction”的文章发现，不同脂肪组织中线粒体基质蛋白酶CLPP的缺失具有截然不同的效应：它可以增强WAT中的氧化磷酸化，但是却损害BAT产热作用，并促进脂质积累（这与白色化表型一致）。与其他线粒体蛋白酶不同，在寒冷暴露时，CLPP水平在BAT中升高，但随着衰老而下降。在一项涉及163只通过随机交配形成遗传背景多样化的小鼠群体的深度BAT蛋白质组学筛选中，CLPP与UCP1呈正相关关系。此外，几个已鉴定的UCP1相互作用蛋白是已知的CLPP底物，进一步支持CLPP与BAT功能之间的密切联系。

该研究显示，BAT中CLPP的缺失通过呼吸链功能障碍驱动脂滴(LD)扩张，且不依赖于耗氧量的变化。这一表型由D-2HG(一种改变染色质和核结构的肿瘤代谢物)的积累所驱动。研究人员揭示了线粒体功能障碍调节表观遗传程序，降低核刚度并促进BAT白色化。这些结果共同揭示了线粒体功能、代谢信号和BAT染色质重组之间的关联，阐明了CLPP缺失如何导致BAT白色化和产热功能受损，拓展了对线粒体在脂肪组织生物学中调控机制的理解。

敲黑板啦！ 

1.线粒体蛋白酶CLPP缺失直接导致棕色脂肪细胞白色化；

2.棕色脂肪细胞白色化由D-2HG的异常积累驱动；

3.D-2HG通过改变表观遗传状态重编程基因表达；

4.D-2HG促进CLPP缺失脂肪细胞核软化。

研究结果

1. BAT中CLPP缺失导致轻度障碍和白色化

为研究线粒体在BAT生理重塑中的作用，研究人员采用了一种缺失线粒体蛋白酶CLPP的小鼠模型(Clpp^−/−，以下简称CLPP-KO)，该蛋白酶参与OXPHOS复合物的合成与维持。BAT中CLPP的缺失导致LDs数量减少但体积增大，使组织呈现白色表型，符合BAT白色化特征(图1a-c)。由于在组织特异性敲除模型(包括全身脂肪组织敲除CLPP-AKO: Clpp^fl/fl; Adipoq-cre和棕色脂肪特异性敲除CLPP-BKO: Clpp^fl/fl; Ucp1-cre)中均观察到类似白色化现象，因此该BAT白色化表型源于BAT自身缺陷而非全身性CLPP缺失(图1a和辅图1a,b)。虽然全身性CLPP缺失会导致体重显著下降，但CLPP-AKO小鼠体重正常，CLPP-BKO小鼠仅出现轻度体重降低(雄性更为明显)(辅图1c)（小编注：本文结果中虽然没有直接展示CLPP全敲体重情况，但本文通讯作者2017年发表了标题为“CLPP deficiency protects against metabolic syndrome but hinders adaptive thermogenesis”的文章中报道了全身性CLPP缺失导致体重减轻的结论）。尽管雌雄小鼠随年龄增长存在天然体重差异，但对CLPP缺失模型的大量实验表明，这些差异不会对研究结果产生决定性影响。因此，研究人员在后续分析中合并了两性数据，并确保所有实验尽可能均衡包含雌雄小鼠。

除脂滴增大外，超微结构分析显示CLPP-KO小鼠的BAT中线粒体数量增加且体积增大，部分线粒体色泽变浅、嵴结构减少，提示OXPHOS功能受损(图1b-c)。从CLPP-KO小鼠、CLPP-AKO小鼠和CLPP-BKO小鼠的BAT中分离的线粒体显示呼吸链复合体I(CI)及含CI的超复合体水平降低，同时CI活性下降(图1d和辅图1d)。与此一致，CLPP-KO的BAT中出现复合体V(CV)亚基F1的积累，其中F1在OXPHOS功能受损时对维持膜电位至关重要（小编注：电子呼吸链的复合物V也被称为ATP合酶或F1F0-ATP合酶，主要由F0和F1两个亚基组成，F1主要负责催化ATP合成。正常情况下，复合物V是一个稳定的蛋白复合体，由于CLPP对于OXPHOS（即电子传递链复合体）的维持发挥着重要作用，而CLPP KO后出现了F1亚基的积累，推测可能是由于电子传递链受损，而线粒体为了维持OXPHOS功能，源源不断地合成F1亚基进行复合物V的组装，导致F1亚基出现积累；另一方面，CLPP是一种可降解错误蛋白的酪蛋白水解酶，在CLPP KO后，由于电子传递链损伤，复合物V可能出现了解聚，导致多余的F1亚基无法被清除而逐渐积累）(图1e和辅图1e)。

CLPP敲除的组织匀浆显示脂解作用减弱，经毛喉素(小编注：毛喉素(Forskolin)是一种提取自毛喉鞘蕊花的化合物，可以通透细胞膜，在不与细胞表面受体相互作用的前提下刺激腺苷酸环化酶AC的活性，使cAMP含量上升。cAMP可以激活蛋白激酶A(PKA)，PKA通过磷酸化脂肪组织中的HSL来增强细胞中储存能量的释放，导致甘油三酯水解)刺激后差异更加显著，表明脂解激活受损(甘油释放)可能是白色化表型的诱因之一(辅图1f)。尽管这些线粒体存在缺陷，BAT裂解液的耗氧率(OCRs)在基础状态和刺激条件下均无变化(图1f)，这可能是由于代偿性线粒体生物合成的作用(图1g)（小编注：number density是线粒体的密度定量，用2500分辨率的透射电子显微镜对WT和CLPP KO条件下的线粒体随机捕获48张图像，随后用ImageJ的unbiased counting frames对线粒体进行定量，其数量密度N=（线粒体数量/counting frames）*area per frame（μm2））。值得注意的是，热中性诱导的白色化涉及线粒体自噬，而高脂饮食驱动的白色化则是在线粒体含量不变的情况下导致脂滴积累。这些发现表明在不同BAT白色化背景和脂滴积累情况下，线粒体响应机制也不尽相同。

为探究潜在机制，研究人员通过CLPP野生型小鼠和BAT敲除小鼠建立了永生化前体脂肪细胞(preAD)培养体系(图1h)。经分化诱导后，这些细胞表现出成熟棕色脂肪细胞(mBA)特征，包括形成多腔脂滴和寡霉素抗性，表明线粒体解偶联发生（小编注：此处主要是指成熟棕色脂肪细胞和永生化前体脂肪细胞相比，在加入寡霉素后OCR下降趋势不明显。因为成熟棕色脂肪细胞大量表达UCP1，线粒体以“解偶联呼吸”为主，质子梯度主要通过UCP1以热能形式释放，而非合成ATP，因此寡霉素对于成熟棕色脂肪细胞的OCR值影响有限）(图1h-k及辅图1g) (小编注：在利用Seahorse进行OCR测量时，主要检测线粒体基础呼吸和非线粒体呼吸耗氧，首先，寡霉素是一种线粒体OXPHOS抑制剂，通过直接靶向ATP合酶的F0亚基，阻断质子回流，减少ATP合成，因此寡霉素的处理会使线粒体OCR下降，用基础呼吸值减去寡霉素处理后的OCR即为ATP产量，此时余下的部分即为质子渗漏造成的耗氧率。加入寡霉素后再加入解偶联剂FCCP，则会破坏质子梯度和线粒体膜电位，使得电子在ETC中的传递不再受限，复合物IV的耗氧达到最大，此时OCR为最大呼吸值，用最大呼吸值减去基础呼吸耗氧量即为细胞储能值，是细胞在基础状态下未被利用的呼吸能力。最后加入鱼藤酮和抗霉素A混合物，鱼藤酮是复合体I的抑制剂，抗霉素A是复合体II的抑制剂，两种物质共同作用会关闭线粒体呼吸，从而计算出线粒体之外的活动所驱动的非线粒体呼吸耗氧)。野生型小鼠与CLPP-KO小鼠的mBAs均显著上调UCP1的表达(辅图1h)。CLPP-KO小鼠的mBAs中脂滴相关蛋白的转录水平明显升高，包括通用标记蛋白PLIN2(亦称ADRP)以及脂肪细胞特异性蛋白PLIN1和PLIN4(辅图1h)。

mBAs的OCR和细胞外酸化率(ECAR)检测显示(小编注：细胞外酸化率(ECAR)主要反映糖酵解总体功能)，野生型与CLPP-KO细胞间即便存在差异也微乎其微(图1j,k)，但是两组mBAs的基础OCR和ECAR均高于preADs，反映出分化后细胞代谢活性的增强。这些结果证实，在野生型和CLPP缺失条件下，mBAs均能精准模拟成熟棕色脂肪细胞的功能特性。

2. 多模态分析揭示组织自主性BAT重塑

为探究CLPP缺失对BAT的整体影响，研究人员首先分析了所有CLPP缺失模型的基因表达(图2a)。通过DAVID进行基因本体(GO)富集分析发现，各基因型有707个共同上调转录本和639个下调转录本。炎症和免疫通路是最显著富集的通路之一(图2a)，这与既往报道中CLPP缺失通过释放mtDNA引发cGAS–STING介导的干扰素刺激基因激活的结论一致。然而，在CLPP-KO小鼠中敲除STING并未改变BAT白色化表型(图2b)，且在CLPP-BKO小鼠的BAT中未观察到免疫细胞浸润，在骨髓中也未见免疫祖细胞扩增(辅图2a,b)。随后研究人员通过可供参考的单细胞转录组数据集进行了细胞类型反卷积分析(小编注：细胞类型反卷积分析可用于推断大量异质组织内细胞群体的组成)，证实了包括免疫群体在内的细胞组成未发生重大变化(辅图2c,d)。

除炎症反应外，CLPP敲除的BAT还显示出与转录调控、信号转导、黏附、迁移、细胞死亡及脂代谢相关通路的上调(图2a)。基因集富集分析(GSEA)揭示了BAT白色化相关通路的富集，如肌动蛋白重塑和血管生成(图2a,c)，而棕色脂肪细胞分化特征呈负富集，肌生成失调(图2d)，表明BAT身份特征可能受损（小编注：BAT是一个高度血管化的组织，具有丰富的线粒体，而毛细血管稀疏是BAT白色化的一个显著特征。2024年发表在Nature上的一篇文章“Sympathetic neuropeptide Y protects from obesity by sustaining thermogenic fat”表明神经肽Y（NPY）可以维持壁细胞（血管系统的重要组成部分）的增殖，而它是产热脂肪细胞的来源，交感神经元中的NPY缺失会导致肩胛骨BAT白色化；另一篇文章“Endothelial SIRT3 deficiency predisposes brown adipose tissue to whitening in diet-induced obesity”表明内皮细胞SIRT3的缺失通过增加脂肪酸合成酶的乙酰化，扰乱脂肪酸代谢从而导致血管生成不足，促进BAT白色化。目前BAT的血管分布在系统代谢中的作用尚未得到详细的研究，但是血管生成在BAT白色化中至关重要，而血管生成通常要经历内皮细胞极化、尖端细胞伸出丝足、迁徙、柄细胞增殖重排形成管腔、周细胞招募、基底膜再建等过程）。鉴于BAT与骨骼肌具有共同的发育起源，研究人员通过分离野生型和CLPP-KO小鼠BAT的基质血管组分(SVF)来检测分化是否受损。CLPP-BKO小鼠SVF的全蛋白质组分析仅显示微小变化，主要涉及线粒体代谢、mtDNA表达和OXPHOS蛋白，而棕色脂肪细胞或肌肉分化标志物未发生改变(图2e)，表明早期BAT发育进程完整。

下调转录本主要包括与细胞器功能障碍相关的线粒体OXPHOS组分和线粒体核糖体亚基(图2a,f)。与此一致，GSEA分析显示各模型中线粒体整合应激反应(mitoISR)均被激活，而CLPP-BKO小鼠BAT中ATF4靶基因表达增加均证实这一点(图2g)。诸如分解代谢(脂肪酸氧化)和合成代谢(脂肪酸与胆固醇合成)等涉及脂代谢的转录本水平也显著降低(图2a)。虽然GSEA证实脂代谢通路整体受抑制，但脂质相关基因呈现正富集（小编注：GSEA数据分析图中富集分数（Enrichment score，ES）反映了该基因集的成员在排序列表顶端或底端的富集程度，因此ES值为负只代表该基因集的成员显著富集在排序列表的底部，若要看基因在整体基因列表中的富集程度，理论上需要结合ES的标准化值（NES）判断是正富集或者是负富集，NES为正代表基因集上调（正富集），负值则为下调（负富集）。但是，文章中没有展示NES的数值，因此不确CLPP KO后脂代谢通路为正富集；我们推测根据主图2h中关于Metabolism of lipids和Fatty-acid metabolism的GSEA数据展示的是在wt组ES为正（左侧出现一个高峰）即wt中显著高表达，而推测是正富集结果），反映了动态重塑过程(图2h)。这种代谢适应可能是脂滴积累的基础，因为CLPP敲除mBA细胞中的OCR基本保持正常(图1j)，排除了低OXPHOS活性这一诱因。

研究人员随后将CLPP-BKO小鼠的转录组与两种BAT白色化模型——热中性环境暴露和赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)BAT特异性敲除(LSD1-BKO)小鼠进行比较。与CLPP或LSD1敲除小鼠相比，热中性暴露改变BAT基因表达更显著；在后两种模型中，仅有不到四分之一的改变是特异性的(图2i)。CLPP-BKO小鼠中约30%的差异表达基因与两种BAT白色化模型重叠(图2i和辅图2e)。三种模型共享的GO分析与CLPP BKO中的富集分析相匹配。值得注意的是，Clpp表达在三种模型中均下降，强调了其与BAT稳态的关联(辅图2e)。

虽然蛋白质组变化不如转录组显著(在CLPP-KO小鼠、CLPP-AKO小鼠和CLPP-BKO小鼠的BAT中共有116个上调蛋白和66个下调蛋白)，但总体上反映了转录水平趋势。GO分析显示线粒体蛋白在上下调两个方向均存在富集(图2j和辅图3a)，其中OXPHOS变化较轻微，但ATP合酶呈现上调趋势，这符合白色化BAT中向ATP生产转变和解偶联减少的特征(图2k)。下调蛋白集中在脂肪酸代谢通路附近，与转录组数据一致(图2j)。

为完善分析，研究人员进行了BAT中胞质线粒体和脂滴周边线粒体(PDMs)的蛋白质组学分析。这些线粒体群体具有独特但部分重叠的蛋白谱，且在CLPP敲除下均显示明显的OXPHOS改变(辅图3b,c)。值得注意的是，胞质线粒体和PDMs均表现出显著的复合体I缺陷和较轻的复合体IV缺陷，与CLPP-KO小鼠心脏线粒体情况类似(图2k和辅图3d)。这些功能损伤在组织水平不明显，可能是由于线粒体生物合成增加所致(图2k)。

综上所述，这些发现表明CLPP缺陷小鼠的BAT白色化并非由分化受损或脂肪细胞-肌细胞转分化驱动，也并非是OXPHOS功能丧失的直接后果。相反，受到抑制的脂代谢转录特征可能是脂滴扩张的基础。BAT转录组的广泛重塑，特别是与转录控制和染色质调控相关GO分析通路的富集，表明了对CLPP敲除的适应性应激反应(图2a)。

3. CLPP缺失导致D-2HG积累并主导白色化进程

BAT缺失CLPP的转录组和蛋白质组分析揭示了广泛的代谢适应性变化（小编注：CLPP缺失的BAT模型中免疫与炎症信号通路被显著富集但是在CLPP-KO的BAT中未观察到免疫细胞浸润；此外参与脂质代谢的转录本水平，包括分解代谢型(脂肪酸氧化)和合成代谢型(脂肪酸和胆固醇的合成)显著降低，但仍有一部分脂质相关基因被正向富集，反映了一个动态的重塑过程；与细胞器功能障碍相关的线粒体OXPHOS组分和线粒体核糖体亚基的转录本表达下调，但是同时线粒体整合应激反应(mitoISR)均被激活，mitoISR的重要靶基因ATF4被显著激活来适应代谢变化）。为进一步验证，研究人员在不同CLPP缺失模型中进行半靶向代谢组学分析。尽管具有显著变化水平的代谢物数量相对较少，但在各模型间观察到了一致的变化重叠(图3a和附表5)。与较大的脂滴表现相一致，长链脂肪酸水平升高，而由支链氨基酸代谢产生的肉碱衍生物出现水平失调（小编注：肉碱合成所必须的氨基酸是赖氨酸和蛋氨酸，赖氨酸提供肉碱分子骨架的主要部分，蛋氨酸提供所需的甲基。而支链氨基酸指的是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，所以支链氨基酸并不能直接合成肉碱。这里原文中应该指的是源自支链氨基酸代谢的肉碱衍生物水平出现失调，以在附表5中提到的Carnitine C5-OH为例，它指的是羟基异己酰肉碱，是支链氨基酸亮氨酸代谢过程中的一个关键中间产物。此外还存在许多脂肪酸代谢过程中产生酰基肉碱也发生的水平失调）(附表5)。在所有变化的代谢物中，2-羟基戊二酸(2HG)上调幅度最为显著，在三种模型中显示2.7至3.7倍的增加(图3a,b)。CLPP缺失的mBA细胞也积累并分泌2HG，提示其潜在的旁分泌功能(图3c和辅图4a)，而KO preADs则无此现象，表明2HG积累是成熟棕色脂肪细胞所特有的(图3d)。

2HG作为α-酮戊二酸(α-KG)的结构类似物，存在D-2HG和L-2HG两种对映异构体。它可由苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)(小编注：PHGDH是丝氨酸合成通路中的限速酶。它的正常功能是将糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸氧化为磷酸羟基丙酮酸，从而开启整个丝氨酸的生物合成过程。丝氨酸是一碳代谢的主要来源，没有PHGDH提供的丝氨酸，一碳代谢就无法顺利进行，从而影响细胞增殖和基因组稳定性。并且PHGDH能够直接催化α-KG还原成D-2HG)或突变形式的异柠檬酸脱氢酶(IDH1和IDH2)催化作用下少量产生。为确定2HG的来源，研究人员分析了所有已知参与其合成的酶的表达情况。PHGDH是唯一在所有CLPP缺失模型中持续上调并且超过5倍的酶(图3e和辅图4b)。PHGDH催化丝氨酸生物合成途径的第一步反应，该途径常作为mitoISR的一部分被激活以应对OXPHOS功能障碍（小编注：在糖酵解过程中产生的中间代谢产物3-磷酸甘油酸，PHGDH能够催化3-磷酸甘油酸（3-PG）转化成3-磷酸羟基丙酮酸（3-PHP），随后在磷酸丝氨酸氨基转移酶1（PSAT1）的催化下，将3-PHP转化成3-磷酸丝氨酸（3-PS）并产生α-KG，3-PS则在磷酸丝氨酸磷酸酶（PSPH）的催化作用下转化为丝氨酸。产生的α-KG能够重新进入三羧酸循环中进行代谢，但是α-KG能够在PHGDH催化作用下转化为D-2HG。积累的D-2HG能够进入细胞核影响表观遗传修饰。线粒体整合应激反应指线粒体功能障碍所激活的整合应激反应，它能够感知线粒体状态，调节线粒体活动，激活一系列修复和适应程序来恢复细胞稳态，并且mitoISR信号传导的一个关键步骤就是上调ATF4的表达，ATF4的高表达会强烈诱导丝氨酸合成通路中三个酶（PHGDH, PSAT1, PSPH）的表达，增加丝氨酸的合成，而丝氨酸是一碳代谢的主要碳源，一碳单位能够用于核苷酸和NADPH的合成，使细胞能够进行适应压力，通过线粒体自噬清除受损线粒体、合成新的线粒体，最终恢复稳态）(图3f)。虽然CLPP-KO mBA细胞中PHGDH蛋白未增加，但其酶活性显著升高(辅图4c,d)。对映异构体特异性分析证实，D-2HG是所有CLPP-KO BAT样本以及分离的成熟CLPP-KO棕色脂肪细胞中的主要存在形式(图3g和辅图4e)，这与已知PHGDH可催化生成D-2HG的多效性特性相符。野生型BAT与野生型mBA细胞间2HG对映体比例的差异可能是由于BAT的异质性，也就是该组织包含多种细胞类型。

为直接验证PHGDH在D-2HG生成中的作用，研究人员使用NCT503(一种通过阻断丝氨酸合成的选择性抑制剂)对其进行抑制。NCT503处理消除了KO mBA细胞中2HG的积累(图4a和附表6)，并广泛改变代谢通路，包括一碳代谢、SAM循环和嘌呤合成(附表6)。值得注意的是，通过荧光激活细胞分选技术证实PHGDH抑制还逆转了白色化表型，KO mBA细胞中脂质含量降低并形成更小的脂滴(图4b,c)。此外，对CLPP-KO小鼠进行两周的NCT503体内治疗后，2HG水平恢复正常且BAT白色化表型发生逆转(图4d,e)。为深入探究D-2HG的作用，研究人员在CLPP缺陷mBA细胞中过表达了负责降解该代谢物的D-2HG脱氢酶(D-2HGDH)。这显著降低了D-2HG水平并部分逆转了白色化表型(辅图4f,g)。相比之下，使用ISRIB抑制ISR虽然抑制了部分ATF4靶基因，但对D-2HG积累或脂质储存没有影响(辅图4h-j)，表明mitoISR并非CLPP缺失后白色化表型的主要驱动因素。最后，研究人员用细胞可渗透的D-2HG(octyl D-2HG)(小编注：Octyl D-2HG是D-2HG的一种酯化衍生物和细胞可渗透形式。它由一个D-2HG分子与一个辛醇(Octyl alcohol)分子通过酯键连接而成)处理野生型mBA细胞，充分诱导脂滴增大(图4b,f)，直接证明了D-2HG积累与BAT白色化之间的因果关系。

综上所述，研究数据表明CLPP缺失会激活PHGDH，导致成熟棕色脂肪细胞中D-2HG积累。这种代谢物有助于促进脂滴扩张和BAT白色化，揭示了异常丝氨酸代谢和D-2HG在线粒体应激表型调控中的关键作用。

4. CLPP缺失与D-2HG处理改变组蛋白甲基化

癌症中升高的2HG水平会抑制α-KG依赖的双加氧酶（小编注：在正常状态下2HG是三羧酸循环代谢的一种副产物，在苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的催化作用下产生，但很快被降解，所以它的生理功能并不显著；在病理状况下，特别是在肿瘤代谢环境发生改变的情况下，2HG水平会异常积累。而2HG因其分子结构α-KG十分相似，它能够通过竞争性抑制的方式抑制以α-KG为底物的双加氧酶，包括DNA去甲基酶、组蛋白去甲基酶等，导致DNA超甲基化，组蛋白甲基化水平异常），影响组蛋白和DNA去甲基化过程，导致广泛的表观遗传重编程。初期对CLPP缺失细胞及D-2HG处理的野生型细胞进行的蛋白质印迹分析未发现关键组蛋白修饰(组蛋白H3第9位赖氨酸二甲基化(H3K9me2)、第36位赖氨酸三甲基化(H3K36me3)、H3K4me3、H3K27me3)的一致性变化(辅图5a)。鉴于该方法的灵敏度有限，可能忽略了细微的表观遗传变化。免疫荧光检测显示H3K9me2和H3K27me3存在微弱不一致的变化(辅图5b)，促使研究人员对H3K4me3(已知受2HG影响的活性启动子标志)进行更深入分析。

染色质免疫沉淀测序(ChIP–seq)分析显示，CLPP缺失和D-2HG处理的mBA细胞中H3K4me3在整体水平上增加，且富集主要发生在启动子区域(图5a和辅图5c,d)。值得注意的是，CLPP缺失细胞中2017个独特H3K4me3峰中有1141个与D-2HG处理细胞重叠，表明存在共同作用机制(图5b和附表7)。对CLPP缺失与D-2HG处理mBA细胞共有的富集位点进行GO分析，揭示了与转录调控、分化、染色质重构、脂代谢、细胞凋亡和DNA修复相关的生物学过程(图5c和附表7)。其中的许多类别也出现在CLPP缺失BAT的转录组分析中(附表1)，这也支持其功能相关性。

对特定基因的深入分析发现，关键成脂调节因子启动子区域上H3K4me3水平增加，包括胆固醇和脂肪酸代谢调节因子SREBP1与SREBP2，以及白色脂肪细胞分化调节因子C/EBPβ(图5d)。这些变化表明D-2HG诱导的染色质重塑可能促进与脂肪生成和代谢相关的转录程序。为进一步验证，研究人员比较了CLPP-KO与D-2HG处理mBA细胞的转录组。CLPP-KO细胞中50%以上发生显著改变的转录本表现出H3K4me3水平的相应变化(图5e和附表7,8)。此外，其中超过1/3的基因与D-2HG处理细胞重叠，表明2HG是CLPP缺失中转录变化的主要驱动因子。

GO分析显示，上调和下调的转录本都富集在与染色质重塑、转录翻译调控和细胞凋亡相关通路中，表明这些过程发生广泛变化(图5f和附表8)。且趋势变化显著：氧化应激和DNA损伤反应相关转录本在上调的基因中富集，而细胞粘附和细胞外基质组织相关转录本在两种模型中均表达下调(图5f和附表8)。

GSEA分析发现了脂质和脂肪酸代谢的实质性变化，这与CLPP缺失的组织中观察到的变化相呼应(图2h和6a)。在CLPP-KO mBA细胞和D-2HG处理细胞中共同上调的转录本中，研究人员鉴定出多个脂代谢相关酶及多种脂质转运蛋白，包括高度上调的CD36——脂肪细胞中脂肪酸摄取的主要调节因子和脂滴生长的关键因子(图6b和辅图5e)。这些转录本在过表达D-2HGDH的细胞中大多被抑制(图6c)。同时，编码成脂调节因子(如Pparg和Cebpb)的转录本在CLPP-KO mBA细胞和D-2HG处理细胞中均上调。相比之下，编码PGC1α的Ppargc1a在CLPP缺失细胞中特异性地诱导表达，这与潜在的线粒体OXPHOS功能障碍一致(图6d)。值得注意的是，Cebpa表达似乎更受线粒体功能障碍而非D-2HG处理的影响(图6d)。相反，胆固醇生物合成基因在CLPP缺失和D-2HG处理的细胞中均呈负富集；这一变化在三种CLPP-KO模型的BAT中也被观察到(辅图5f)，表明细胞与组织间具有强烈相似性。

编码SREBP1和2(Srebf1, Srebf2)的转录本及其靶基因(包括编码胆固醇生物合成初始限速步骤关键催化酶Hmgcr和Hmgcs1)均发生改变(图6e)。这些变化与CLPP缺失和D-2HG处理细胞中胆固醇水平降低相一致，类似于胆固醇生物合成抑制剂辛伐他汀的作用(图6f)。

这些发现共同证明，CLPP缺失与D-2HG处理诱导了相似的转录组和表观基因组变化，这些变化集中于染色质调控、成脂信号传导和胆固醇代谢，将线粒体功能障碍与协调的代谢重编程联系起来。

5. D-2HG介导CLPP-KO棕色脂肪细胞核软化

对CLPP缺失组织和细胞的转录组及H3K4me3 ChIP-seq变化的GO富集分析持续鉴定出与细胞粘附、迁移、肌动蛋白细胞骨架组织和转录调控相关的通路(图2a、5c,f及附表1,7,8)。大量富集的转录本定位于细胞核、核质和核周胞质区。这与新出现的、将核内结构与细胞应激反应联系起来的证据相一致。CLPP-KO与D-2HG处理的细胞的细胞核相关转录本的重叠支持了这一联系(辅图6a)。GSEA进一步显示CLPP缺失BAT中核膜相关转录本呈强烈负富集，与D-2HG处理细胞的转录组特征高度匹配(辅图6b)，表明代谢扰动可能影响核及细胞形态。

      研究人员随后探究了D-2HG、表观遗传改变与核表型间的联系。超微结构分析显示CLPP缺失的棕色脂肪细胞存在显著核变形特征，表现为线粒体聚集在核膜附近并呈锯齿状图7a)。通过连续切片阵列断层扫描技术构建的高分辨率三维(3D)重建模型，可进一步观察CLPP缺失的BAT中线粒体-核相互作用的程度(图7b和补充视频1)。虽然未检测到共用膜的直接接触位点，但两种膜结构紧密相邻，其间仅嵌有极少的内质网(辅图6c,d和补充视频2)。

       对线粒体-核膜内陷的量化分析显示，其在CLPP缺失细胞中的数量从野生型的每个细胞核约1.3个增加至约2.9个，部分细胞核甚至出现多达10个内陷(图7c)，表明核力学特性发生改变。通过原子力显微镜(AFM)检测，研究人员发现CLPP缺失的脂肪细胞中的核硬度显著降低，而D-2HG处理的野生型细胞也出现类似现象(图7d,e)。使用NCT503抑制PHGDH(可降低D-2HG水平)能恢复CLPP缺失细胞的核硬度(图7f)。相比之下，ISRIB处理未显著改变D-2HG水平，且对核膜硬度无影响(辅图6e)。这些发现建立了代谢改变与核形态之间的功能联系，该联系受D-2HG调控但独立于经典ISR通路。

       胆固醇能增加膜硬度，尤其在饱和脂质环境中，但在富含不饱和脂质的膜中作用较弱。尽管核膜主要由不饱和磷脂组成，但胆固醇合成增加与核膜硬度和脆性增加相关。由于CLPP缺失和D-2HG处理细胞显示胆固醇水平降低，研究人员测试了补充胆固醇是否能恢复核硬度。胆固醇处理显著提高了两种模型细胞的核硬度，甚至超过野生型细胞中观察到的水平(图7g)。相反，使用胆固醇合成抑制剂辛伐他汀处理则进一步降低核硬度(图7g)，凸显了胆固醇作为核膜力学关键调节因子的作用。

       为验证这些效应是否超越CLPP缺失范畴，研究人员用放线菌素(小编注：放线菌素（actinonin）和放线菌素D（Actinomycin D）是不同的两种化合物；Actinomycin D是一种复杂的环肽，它的核心功能就是嵌入DNA中从而物理性地抑制RNA的转录，阻止基因的表达导致细胞凋亡；actinonin是一种羟基胺类抗生素，是一种可逆的、强效的、具有高度选择性的肽脱甲酰基酶（PDF）抑制剂，而在蛋白质合成过程中，需要PDF酶去除N-甲酰甲硫氨酸上的甲酰基，否则蛋白质无法正确折叠和形式功能，而actinonin能够选择性的抑制线粒体中PDF酶的功能，导致核编码的线粒体蛋白和线粒体核糖体蛋白都无法正常发挥功能，进一步导致mtDNA编码的OXPHOS亚基无法正常组成，所以actinonin可以用于研究线粒体蛋白质合成、线粒体功能紊乱、以及线粒体在细胞凋亡和疾病（如癌症）中的作用）处理野生型mBA细胞。短期放线菌素处理显著提高野生型mBA细胞的2HG水平，并适度增加脂质积累(图7h,i)，表明线粒体功能障碍可迅速引发代谢重编程。同时伴随核硬度两倍以上的下降(图7j)，提示OXPHOS损伤通过快速代谢重构广泛影响核力学特性。（小编注：OXPHOS损伤时，线粒体无法有效利用糖酵解产生的丙酮酸，为细胞补充能量，糖酵解效率增加中间产物3-PG积累，而3-PG 是 PHGDH 的直接底物，使得PHGDH被激活；OXPHOS损伤会导致能量危机和氧化应激，触发生存信号；这些生存信号会激活PHGDH，PHGDH激活驱动丝氨酸合成和一碳代谢，产生NADPH和谷胱甘肽来缓解氧化应激，并产生核苷酸来支持细胞增殖；OXPHOS损伤导致线粒体应激会通过信号通路激活转录因子ATF4，ATF4 可直接结合PHGDH基因的启动子区域，促进其转录。PHGDH的激活能够直接催化2HG的生成）

       综上所述，这些发现揭示线粒体功能障碍驱动代谢重编程，从而重塑核结构与力学特性。研究人员提出PHGDH激活及随之而来的D-2HG积累会诱导细胞核软化，该过程具有可逆性且对胆固醇敏感(图7k)。尽管本研究聚焦于BAT白色化和CLPP缺失，类似的代谢-核耦合机制很可能发生于其他OXPHOS功能障碍和脂质积累环境中，值得进一步深入研究。

总结 

本研究阐明了在线粒体基质蛋白酶CLPP缺失的棕色脂肪组织中驱动白化表型的机制。研究发现CLPP缺失的BAT表现出异常的脂滴积累，并且这种异常的脂滴积累独立于氧消耗和脂肪酸氧化的缺陷。同时CLPP缺失引起的线粒体功能障碍导致了肿瘤代谢物D-2HG的积累，进而促进了脂滴的增大。研究人员又进一步证明了D-2HG通过改变表观遗传特征来影响基因表达和降低细胞核硬度。表明2HG参与调控脂质积累和核硬度改变是BAT线粒体功能障碍的关键。

原文链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12373511/