英文原题：Engineering of cofactor preference and catalytic activity of methanol dehydrogenase by growth-coupled directed evolution

作者：Jinxing Yang, Liwen Fan, Guimin Cheng, Tao Cai, Jibin Sun, Ping Zheng*, Shuang Li*, Yu Wang*

01 论文信息

论文信息

J. Yang, L. Fan, G. Cheng, et al. Engineering of cofactor preference and catalytic activity of methanol dehydrogenase by growth-coupled directed evolution[J]. Green Carbon 2024 2(2) 242-251.

论文关键词

Growth-coupled screening; Methanol dehydrogenase; Cofactor engineering; Directed evolution; C1 bioconversion

论文网址

https://doi.org/10.1016/j.greenca.2024.03.004

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Engineering of cofactor preference and catalytic activity of methanol dehydrogenase by growth-coupled directed evolution

中文解读原链接

Green Carbon文章│天津工生所王钰研究员、郑平研究员与华南理工李爽教授：生长偶联的甲醇脱氢酶活性与辅因子偏好性进化

02 背景简介

随着全球人口持续增长和气候环境不断恶化，人们对于利用非糖基碳源替代目前广泛使用的糖基碳源进行生物制造的关注度不断增加。以甲醇为代表的一碳原料，具有来源广泛、成本低廉、便于运输等优势，被认为是一种极具前景的生物制造原料。NAD⁺依赖型甲醇脱氢酶（MDH）催化甲醇氧化生成甲醛，伴随着NADH的生成，是甲醇生物利用的首步反应。然而，MDH的催化活性较低，且无法实现NADPH的再生，限制了其在甲醇生物转化利用中的应用。

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所的王钰研究员、郑平研究员与华南理工大学的李爽教授合作在Green Carbon上发表了题为“Engineering of cofactor preference and catalytic activity of methanol dehydrogenase by growth-coupled directed evolution”的研究文章。他们设计了一种基于辅因子营养缺陷型的生长偶联定向进化策略，用于提高MDH的催化活性并改变其辅因子偏好性（图1）。筛选获得的突变体可以为构建高效的甲醇生物转化细胞工厂提供性能优秀的催化元件。

图1. 生长偶联的MDH定向进化策略示意图

03 文章简介

体内筛选模型的设计与验证

为了设计生长偶联的MDH突变体筛选系统，作者首先敲除了E. coli MG1655中编码二氢硫辛酸脱氢酶的lpd基因。该基因是丙酮酸脱氢酶复合体、α-酮戊二酸脱氢酶复合体以及甘氨酸裂解酶复合体中的关键亚基，该基因的敲除会导致这些复合体酶失活，使菌株利用乙酸作为唯一碳源时，无法再生NADH，成为了NADH营养缺陷型（NADHₐᵤₓ）菌株。在同时添加乙酸盐和甲醇的基本培养基中，MDH催化甲醇氧化合成的NADH可供给细胞生长，从而建立了MDH催化活性与细胞生长速度的正向关联（图2）。

此外，将E. coli MG1655中参与NADPH再生的酶编码基因如数敲除，所得到的敲除菌利用葡萄糖作为唯一碳源时无法再生NADPH，成为了NADPH营养缺陷（NADHₐᵤₓ）菌株。当往基本培养基中补加甲醇时，可实现NADPH再生的MDH突变体可以催化甲醇氧化合成NADPH，供给细胞生长，从而建立了MDH对NADP⁺的活性与细胞生长的正向关联（图2）。

图2. NADH与NADPH营养缺陷型E. coli的构建与应用示意图

MDH的催化活性进化

为了筛选得到催化活性提高的MDH突变体，研究人员首先构建了MDH的随机突变文库，并将文库转化至NADH营养缺陷型菌株，通过连续传代培养的方式富集具有较高活性的MDH突变体（图3）。其中，MDH突变体S5（V37A）对甲醇的催化效率相较于野生型提高了约19倍。结构分析表明，V37A邻近由C38、T40、H61、C148四个氨基酸残基所组成的关键催化区域。该位点的突变导致了局部疏水作用的改变，因此有利于甲醇分子的进入并引发催化反应的进行。

图3. 活性提高的MDH突变体使NADH营养缺陷型具有更快的生长速度

MDH的辅因子偏好性进化

为了筛选得到可用于NADPH再生的MDH突变体，研究人员通过半理性设计的方法预测了影响辅因子偏好性的关键氨基酸残基，并构建了定点饱和突变文库。同样，通过连续传代培养的方式，研究人员最终分离得到6个MDH突变体。通过进一步酶学性能表征，证实了这些突变体对NADP⁺具有偏好性。其中，在以NADP⁺为辅因子的条件下，SM2（D195S、I196R、K242I）表现出最高的酶活（图4）。

图4. MDH突变体以NAD⁺和NADP⁺为辅因子的催化活性表征

随后研究人员构建了突变体SM2的同源模型并发现D195S、I196R、K200K与NADP⁺的2’-磷酸基团形成了新的相互作用力，故而增加了对NADP⁺的亲和性（图5）。通过将上述筛选得到的V37A点突变引入到SM2突变体，构建获得的突变体SM7酶活进一步提高，其对NADP⁺的偏好性是野生型MDH的90倍。

图5. 突变体SM2与周边氨基酸残基的相互作用力

总结及展望

NAD⁺依赖型MDH是甲醇等一碳原料生物转化的关键酶。针对其催化活性低、无法再生NADPH的问题，本研究构建了NADH和NADPH营养缺陷型菌株，并利用其作为生长偶联的MDH突变体筛选平台，成功获得了催化效率大幅度提高和辅因子偏好性显著改变的MDH突变体。本研究设计的基于辅因子营养缺陷型菌株的筛选策略，也为其它NAD（P）⁺依赖型催化元件的定向进化提供了通用的筛选平台。

04 文章摘要

Abstract

Methanol, produced from carbon dioxide, natural gas, and biomass, has drawn increasing attention as a promising green carbon feedstock for biomanufacturing due to its sustainable and energy-rich properties. NAD⁺-dependent methanol dehydrogenase (MDH) catalyzes the oxidation of methanol to formaldehyde via NADH generation, providing a highly active C1 intermediate and reducing power for subsequent biosynthesis. However, the unsatisfactory catalytic efficiency and cofactor bias of MDH significantly impede methanol valorization, especially in NADPH-dependent biosynthesis. Herein, we employed synthetic NADH and NADPH auxotrophic Escherichia coli strains as growth-coupled selection platforms for the directed evolution of MDH from Bacillus stearothermophilus DSM 2334. NADH or NADPH generated by MDH-catalyzed methanol oxidation enabled the growth of synthetic cofactor auxotrophs, establishing a positive correlation between the cell growth rate and MDH activity. Using this principle, MDH mutants exhibiting a 20-fold improvement in catalytic efficiency (kcat/Km) and a 90-fold cofactor specificity switch from NAD⁺ to NADP⁺ without a decrease in specific enzyme activity, were efficiently screened from random and semi-rationally designed libraries. We envision that these mutants will advance methanol valorization and that the synthetic cofactor auxotrophs will serve as versatile selection platforms for the evolution of NAD(P)⁺ -dependent enzymes.

05 作者简介

王钰 研究员

王钰，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员，博士生导师，Green Carbon青年编委。主要从事工业微生物的基因编辑育种和一碳原料的生物转化研究，以第一或通讯作者在Nat. Commun.、Nucleic Acids Res.、Trends Biotechnol.、Metab. Eng.等期刊发表论文40余篇，申请和授权发明专利40余项。主持国家自然科学基金委优青项目、中国科学院关键核心技术攻坚先导专项等项目。入选《麻省理工科技评论》亚太区“35岁以下科技创新35人”、“伦世仪教育基金”杰出青年学者、日本生物工学会DaSilva Award奖等荣誉。兼任中国生物工程学会青年工作委员会和一碳生物技术专业委员会、中国遗传学会微生物遗传专业委员会、中国化工学会生物化工青年委员会的委员，以及中国科学院青年创新促进会生命分会副会长等职务。

李爽 教授

李爽，华南理工大学生物科学与工程学院教授，博士生导师。2001年和2006年分别获清华大学学士和博士学位。2007年在华南理工大学任教至今，历任讲师、副教授和教授。入选广东省特支计划“科技创新青年拔尖人才”（2019），广州市“珠江科技新星”（2012）。主要研究兴趣包括：关注合成生物学研究方向，建立了以酿酒酵母、大肠杆菌为底盘细胞的合成生物学相关技术平台。在微生物底盘细胞改造、菌株驯化、人工途径精细调控方面取得了重要成果。近年在Angew. Chem. Int. Ed.、Green Chem.等杂志上发表研究论文40余篇。研究成果获得国际授权发明专利2项，中国授权发明专利10余项。多项科研成果转化。

郑平 研究员

郑平，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员，博士生导师。天津市滨海新区杰出科技人才。长期从事细菌的代谢工程和系统生物学研究，致力于创建绿色、高效、低成本的生物制造体系，提升推动传统生物及化工企业转型升级。先后在Nature Communication、Trends in Biotechnology、Metabolic Engineering、ACS Synthetic Biology、Biosensors and Bioelectronics、Biotechnology for Biofuels等国际知名期刊共发表SCI论文60余篇，申请发明专利50余件，获得中国专利授权16件，美日欧等国际专利授权6件。

06 Green Carbon

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