【EFL进展】NC：生物支架的“缩骨功”

目前生物支架是组织再生修复的有效手段，但生物支架的植入过程需要大手术，创伤大，恢复周期长。微创手术具有切口小，恢复快等优势，目前在手术占比中越来越大。那能否改造现有的生物支架，将创伤的再生修复过程由大手术切口变为为微创的小切口呢？武林高手可通过缩骨功钻过很小的洞口，为了适应微创手术场景下的再生修复，同样需要赋予生物支架“缩骨功”能力，即以收缩的方式进行微创递送，实现顺利通过小切口，到达创伤位置后再还原。

三种基于水凝胶支架的软组织缺损修复

受膨化食品受潮后皱缩变软现象启发，我们提出了“打印+冻干+潮化”的新方法，赋予生物支架的缩骨功，体积可收缩90%。首先打印生物支架，并将其冻干。然后将冻干的水凝胶支架暴露于水蒸气环境中，使其受潮并大幅度缩小。最后通过注射方式将其微创植入，植入后支架自发再溶胀还原至原始大小，实现内部创伤的再生修复。相关研究以“Minimally invasive soft tissue repair using shrunken scaffolds”为题近期发表在《Nature Communications》。浙江大学机械工程学院贺永教授与浙江大学医学院附属邵逸夫医院林辉教授为论文共同通讯作者，共同第一作者为谢明君博士后、金晟曦博士、喻康博士。

“冻干+潮化”支架后处理方法及应用

l  体积显著缩小，便于微创注射

水凝胶支架尺寸足够小是决定其能否成功注入患者缺损部位的关键因素，因为小尺寸允许支架通过细注射针。本工作提出的“冻干+潮化”引发水凝胶支架皱缩的过程类似于膨化食品（面包、爆米花、薯片等）吸收空气中的水蒸气后皱缩变软的现象。在冻干过程中，冰晶在水凝胶支架内形成并升华。由于水凝胶分子网络的析出，形成了带有裂缝的宏观尺度的薄壁。冰晶完全升华后，内部孔隙随之形成。支架取出后空气通过裂缝进入内部孔隙。在潮化过程中，水蒸气中的水分子可通过内部孔隙上的裂缝顺利进入冻干支架，并不断排出内部的空气，从而避免产生阻碍水分子进入的气泡。一旦水分子到达内部孔隙，在氢键的作用下，其可作为介质与内部孔隙壁上的多个亲水基团结合，导致裂缝和内部孔隙壁折叠并粘附。因此，冻干支架在宏观尺度上逐渐收缩，并进一步排出内部空气。一旦结合水的体积等于内部孔隙的总体积，即内部空气完全被水替代，潮化引导的收缩过程便完成了。

潮化处理引导的水凝胶支架体积缩小过程

l  降低机械模量，减少异物感

组织工程中可注射支架的可行性涉及其在患者体内避免引起异物感的能力。由不同生物材料构建的组织工程支架具有不同的机械性能。与硬组织（如骨骼和软骨）相比，软组织对外来材料的植入高度敏感，这凸显了具有低机械模量的可注射支架在保护患者免受二次损伤方面的重要性。通过对经历不同潮化时长的冻干支架施加压缩力，其压缩结构形态的差异表明，所提出的“冻干+潮化”方法可能会影响支架的机械性能。最初，在冻干后，支架内会形成带有裂缝的薄内孔隙壁，从而产生多孔结构。由于缺少水的润滑作用，这些裂缝的界面会产生高摩擦力，导致在压缩下结构碎裂。在潮化初期，结合的水分子起到一定的润滑作用，减少了压缩下内孔隙壁之间的摩擦力。值得注意的是，在此阶段，内孔隙壁和裂缝迅速相互粘附，形成更厚的壁，这将大大增大支架整体的压缩模量；在潮化中期，最内层的内孔隙壁和裂缝与更多的水分子结合并溶解，开始发生凝胶化转变。由于凝胶化范围最初较小，且内孔隙壁的其他部分仍相对干燥，因此支架将表现出部分凝胶特性，变得更柔软且更具弹性。在潮化晚期，内孔隙壁已完全经历凝胶化转变并略微吸收更多水分子，表现出完全的弹性。

潮化处理引导的水凝胶支架力学模量降低过程

l  吸水再溶胀，快速恢复原始形状

在将潮化支架注入软组织缺损部位后，它应通过吸收周围的体液或辅助注射液恢复至原始体积，以顺利填充皮下腔隙。如上所述，在潮化过程中，水蒸气渗透进入冻干支架的内部孔隙，水分子与亲水基团结合，导致其皱缩并发生初始凝胶化转变。然而，在实际情况下，水分子与亲水基团的结合是随机的，这导致大量亲水基团处于不饱和状态，并被皱缩的内部孔壁所覆盖。因此，一旦潮化支架浸入水中，潮化支架可以继续吸收更多水分，这一过程称之为再溶胀。与潮化处理中使用的水蒸气不同，液态水提供了充足的水分子，并产生更大的外部压力，使其能够迅速进入潮化支架并与其内部的亲水基团结合。随后，皱缩的潮化支架内孔隙壁迅速展开并再溶胀至初始尺寸。

潮化支架的再溶胀过程

l  适配的微创手术工具——“生物子弹”与“生物枪”

考虑到微创手术便利性和批量生产的潜力，将潮化支架设计成“生物子弹”，即将潮化支架装入玻璃管中并进一步压平，从而进一步减小其体积并便于保存。在这里，我们将以脂肪缺损修复为例，来论证所提出策略的可行性。用于脂肪缺损修复的生物子弹被设计为网格支架，以促进细胞迁移和营养物质扩散。然后，将光固化打印出的网格支架进行冻干和潮化处理使其体积缩小。最后，根据脂肪缺损的大小，将潮化支架逐一压入无菌玻璃管中，构成生物子弹备用。

“生物子弹”制造过程及其理化特性

将脂肪干细胞（ADSCs）接种到再溶胀的生物子弹上。培养7天后，ADSCs迅速迁移，均匀附着在生物子弹的整个表面，并继续沿着支架中的网格孔隙向下生长。活/死细胞染色结果显示，在7天的培养过程中，细胞存活率保持在95%以上，表明所提出的生物子弹对ADSCs的生物毒性可以忽略不计。Western blotting（WB）检测结果表明，在7天的培养期间，生物子弹和孔板上的ADSCs均稳定表达CD44，且不表达CD19，这证实了在整个培养过程中ADSCs保持了细胞干性。这些结果验证了生物子弹具有优异的细胞相容性，及其在脂肪组织缺损临床修复中的潜在应用。

“生物子弹”的生物相容性测试

此外，通过参考枪的结构，设计了一种便携式装置，称为“生物枪”，以便于微创注射生物子弹。所构建的生物枪由推杆、扳机、滑块、枪管、弹膛、装有磷酸盐缓冲液（PBS）的注射器、生物子弹弹匣、连接器、生物子弹出口和PBS出口组成。微创手术前，将生物子弹装入弹匣，并将装有PBS的注射器插入弹膛。然后，将生物枪的针头刺入软组织缺损区域，按下扳机与推杆，将生物子弹与PBS注入缺损区域。

“生物枪”的结构与使用方法

l  基于“生物子弹”与“生物枪”的脂肪缺损微创修复

在修复脂肪组织缺损的应用中，期望的治疗目标是实现外观的恢复和脂肪组织的再生。为此，使用了来自癌症研究所（ICR）的8周龄雌性小鼠。选择小鼠腹股沟区域的皮下脂肪作为手术区域。在小动物超声成像系统的引导下，完成了基于生物子弹和生物枪的微创植入过程。在B超可视化下，缺损表现为低回声区，而生物枪针头表现为高回声区。定位后，将生物子弹与PBS一起注入脂肪组织。体内成像系统（IVIS）捕获的图像显示，生物子弹在体内10分钟内迅速膨胀，将其取出后可以看到其覆盖面积扩大了近四倍（从3.35±0.60 mm²扩大到11.27±0.75 mm²），这证实了在体内生物子弹能够像体外一样正常再溶胀并填充整个缺损空间。在第14天，生物子弹被脂肪组织紧密包裹，支架呈半透明状，脂肪组织呈乳白色。在第28天，支架基本上被细胞填满，但脂滴细胞的含量仅为约30%，且主要出现在“生物子弹”的周边区域。在第40天，支架内部填充了大量空泡状脂肪组织，细胞面积占70%，支架内新生脂肪组织附近形成了血管细胞。

基于“生物子弹”和“生物枪”的小鼠脂肪缺损微创修复

文章来源： https://doi.org/10.1038/s41467-024-51248-2