为了与目前比较流行的超分辨单分子成像区别开，需要说明的是这里所讲的高分辨单分子荧光光谱并非指空间分辨率而是指光谱分辨率。我们知道在室温下一个染料分子的吸收和荧光光谱是比较宽的，其半高宽大约在几十个纳米。这是因为在室温下由于受到周围环境（溶剂分子等）的影响，其光谱线被展宽，各个振动能级之间的跃迁被展宽后发生严重的光谱重合从而得到较宽的吸收和荧光光谱。虽然不同的单分子拥有自己特定的环境，光谱也可能会有细微的差别，但是由于这种差别相对于其整个光谱来说非常微弱，因此室温下不同单分子之间的光谱分辨率是非常低的。相对来讲，当把温度降低至几个开尔文时（如液氦温度以下），由于热动力学基本被阻止，周围环境对分子谱线的展宽全部消除，因此单个分子的吸收和荧光光谱将是镜面对称的几条非常窄的谱线也叫零声子线（zero-phonon-line （ZPL））。在极低温度下，如1.2 开尔文，这种谱线宽度只受限于其荧光寿命，大约几十兆赫兹（相当于~10-7纳米）。普通的光谱仪的分辨率已不足以分辨其光谱宽度，因此需要其它方法进行荧光光谱研究，其中最常用的是荧光激发谱。由于光谱仪分辨率太低，但是激光的光谱线却可以达到非常窄（几兆赫兹甚至千赫兹量级），因此可以通过扫描激光的频率（波长）对分子的光谱性质进行研究。另外，低温下单分子的零声子线同时提供了实现单分子的另一个维度。因为一般情况下要实现单分子检测，必须将不同的分子进行分散开来，室温下通常是将样品溶液进行高度稀释，从而实现分子之间的空间分辨，即分子与分子间距大于光的衍射极限，从而在成像时可以区分彼此。而零声子线可以在光谱角度对分子进行分散，即使在衍射极限的光斑内有多个分子甚至上千个分子，每个分子的不同环境造成其零声子线的位置不同，通过调控激发光的频率，可以从中选择特定的分子进行研究。

由于低温条件的限制，室温下商用的荧光显微镜不能直接使用，而且很多光学组件以及机械装置也不能使用，因此低温单分子光谱装置大部分是自主搭建的激光扫描共聚焦显微系统。同时低温单分子光谱对于样品制备和激发光源要求都比较严格，下面会详细解释。

在液氦温度下，荧光分子及其周围溶剂分子的各种热运动、振动达到最小化， 分子的光谱变得非常窄，因此整个体系中细微的扰动都将改变分子光谱位置和形状。这种敏感性对样品的制备提出了更高的要求。低温单分子样品一般是将低浓度荧光分子稀释到固态基质（低温下一般为晶体）中。为了得到稳定的单分子光谱，首先要求所选用的荧光分子具有较高荧光量子产率，很好的光稳定性，很低的系间窜越几率。除此之外，对于基质的要求也比较高，一般来说基质在低温下的最好能够形成单晶结构，晶体结构越稳定，越有序，荧光分子的稳定性越好，越利于单分子光谱研究。而无论晶体机构还是分子本身结构的无序性都会给体系带来动力学扰动，以致降低分子的稳定性，不利于单分子研究。当然也有很多研究成功展示了多晶中的单分子光谱性质，但是其光谱稳定性，分子稳定性等都大不如单晶体系。目前研究较多，比较成功的染料主要是一下芳香烃及其衍生物，而基质主要分为几类：芳香烃晶体，长链烃类，聚合物，以及一些小分子晶体。样品制备的方法主要有两种：共升华结晶和速冷法。

共升华结晶

截止目前所报道的最稳定的单分子体系还是在芳香烃晶体中的芳香烃荧光分子。这种样品一般是芳香烃分子形成单晶结构，中间掺杂荧光分子，该体系对于分子的选择要求较为严格，首先基质分子必须能够形成较好的单晶，其次荧光分子必须具有合适的分子结构使其能够取代一个或几个基质分子实现低浓度掺杂。同时该体系还对荧光分子与基质分子的光谱性质有一定的要求，比如二者不能发生光物理或光化学反应，不能发生能量传递，激发态淬灭等现象。这种体系一般通过将基质分子和荧光分子共同升华结晶来制备，

图3.2.1 共升华法制备晶体样品装置示意图

简易装置如图3.2.1所示：将基质分子置于大试管中，在试管内基质样品的上方用一个小试管盛荧光分子。大试管和小试管有着各自独立的加热系统来控制不同的温度。当基质分子和荧光分子被加热升华后，遇到冷却板形成结晶，晶体中荧光分子的浓度可以通过改变两个样品的温度来控制。为了避免荧光分子或基质分子在制备过程中发生化学氧化，在整个制备过程中，体系保持真空或低压的惰性气体。研究表明，惰性气体的种类以及压力等都会对晶体的结构以及荧光分子的掺杂位置造成影响。

速冷法

低温样品制备的另一种常用方法是速冷法。速冷法一般得到基质分子的多晶结构，因此荧光分子的稳定性和光谱性质相对不稳定，而且分子与分子间的差异性更大。这种制备方法较适用于室温下为液体的基质分子，或熔点较低的基质分子。其制备过程相对简单：将荧光分子溶解到基质中（如果基质分子室温下为固体，则加热使其熔解），通过稀释达到适当浓度后，滴到盖玻片上后在其上方盖上另一片盖玻片形成三明治结构，这种结构可以大大减小样品的厚度，有利于降低背景噪音干扰和单分子探测。将该三明治结构迅速通过液氮或其它冷却介质制冷，达到熔点一下并形成结晶。这种制备方法相对简单而且使用范围广，因此也被广泛应用。

低温单分子装置通常为自主搭建的激光扫描共聚焦显微镜，与普通的共聚焦显微镜不同的是样品需要在低温制冷装置中，因此为了得到较高的收集效率，物镜往往也置于制冷装置中。样品的移动以及焦距的调节均可以通过压电装置完成。

低温单分子光谱对于激发光源有着特殊的要求，因为单个分子的光谱很窄，大约几十个兆赫兹，相当于几百万分之一纳米，要想在该尺度下分辨不同的分子，就要求激发光光谱的线宽应小于分子的光谱线宽，一般为几兆赫兹。同时激发光的波长稳定性要非常好，在扫描和检测过程中波长不能发生改变（小于兆赫兹级别），否则激发光的变化将直接影响激发效率而不能激发荧光分子致使无法分辨是分子的稳定性不够还是激光稳定性不够。目前比较常用的是相干公司的环形腔激光器，锁模后可以达到很好的稳定性和很窄的线宽。当然现在一些商业二极管激光器也可以达到此要求。

在低温下，单分子光谱最重要的特征之一是分子的激发谱线宽，分子的线宽可以提供丰富的信息。将激光固定聚焦在单个分子上后，进行激发光频率扫描，可以得到该分子的激发光谱。当然由于低温样品的浓度可以比较高，因此在同一位置上如果扫描频率范围大的话，可以检测到多个分子。单个分子的激发光谱形状为洛伦兹曲线，通过拟合可以得到光谱的线宽以及强度。荧光强度由于受到很多条件（激发光强度，偏振，分子方向，显微镜收集效率，滤光片的使用以及探测器的效率等）的影响，不能直接进行比较和讨论，但光谱的线宽只受实验条件和激发光强度的影响，不仅能反应分子自身的性质，也可以反应局部环境的性质。当分子处于非常稳定的晶体中，如dibenzoterrylene (DBT)分子在蒽中，体系的扰动在低温下被最小化，分子的线宽（~30兆赫兹）仅仅取决于DBT分子的荧光寿命~5 ns，而且不同的分子线宽分布比较集中，都在25-40兆赫兹范围内1。但是当体系中引入扰动后，比如在聚合物或者长链烃的晶体中，分子的线宽由于光谱的不稳定以及晶体中声子振动等影响而变宽，而且不同的分子间差别比较大，分子线宽分布在从寿命极限的几十兆赫兹到几百兆赫兹甚至更宽。因此分子线宽一定程度上反应了晶体中的扰动信息以及均匀性和结构有序性。有些情况下，即使相同的晶体结构，如果分子结构比如对称性等和取代基发生变化，对染料分子的线宽也会有较大影响。对比DBT/蒽体系和DBT/二甲基蒽体系，基质分子一端引入的两个甲基对于基质的晶体结构影响不大，他们几乎具有相同的晶格，但是由于分子对称性打破，分子在长轴方向上可以随机分布而造成了染料分子局部环境的很大差异，而且甲基本身的不稳定性也为系统引入了动力学扰动。实验结果显示在二甲基蒽中，DBT分子线宽比在蒽中的线宽增大了三十多倍，线宽的分布也较宽2。

分子线宽除了受体系的影响，也受激发光能量和温度的影响。随着激发光能量增加，谱线逐渐变宽，其依赖关系为：

其中γ为当激发光强度为I时的分子线宽，γ0和I0分别为分子荧光寿命极限的线宽和饱和激发强度 1,2。当然分子的荧光强度也随激发光强度呈如下关系：

分子线宽及其荧光强度随激发光强的变化曲线称为饱和曲线，饱和曲线的测定是低温单分子研究基本的表征实验之一，它不仅可以对染料分子进行表征，优化实验条件，也可以揭示比如线宽增宽的机制等基本的光物理过程。

单分子激发谱的另一个重要特征为分子谱线的位置即频率。分子谱线的频率受周围局部环境的影响非常大，因此不同的分子的光谱位置完全不同。外部条件的变化往往会影响到样品中局部位置的细微变化，因此分子谱线的频率对各种实验条件非常敏感，包括温度，压力，电场，振动等。基于其对这些因素的敏感性，低温下单分子可以用作探针来探测周围局部环境的性质。

低温下由于分子线宽非常窄，而且对环境非常敏感，因此局部环境的细微变化都可能改变分子光谱性质（包括线宽变化，频率变化等）。单分子光谱中，分子光谱频率随时间发生变化称为光谱扩散或光谱跳跃。光谱扩散的速率和跳跃的范围均随其机制的不同而不同，它可以非常快，小于微秒量级，也可以慢到毫秒甚至秒量级。 由于实验中激光频率扫描（激发谱测量）时间分辨率较低， 当光谱扩散非常快时，实验结果中并不能直接观测到光谱扩散现象，但是会得到较宽的激发谱，而且饱和激发强度会增高。光谱跳跃最为广泛的机制分子与周围某个二能级体系耦合的结果：当分子附近存在一个二能级体系时，即该体系有两个最低势能井，该体系可以在光诱导或者热力学诱导下在两个势能井之间跃迁，当荧光分子与该二能级系统耦合时，分子的谱线位置受二能级系统的影响而分布在两个不同的位置，从而展现为分子光谱在两个不同频率之间跳跃。荧光分子与两个或多个二能级系统耦合时，分子的跳跃将变得越来越复杂。造成光谱扩散或跳跃的另一个机制为低频率振动模式，即在晶体中特别是温度在几个开尔文到几十个开尔文之间时，晶体的低频率振动模式使得分子周围环境变化而展现光谱扩散或跳跃。分子扩散或跳跃的范围可以在激发谱随时间的变化图中看出，当然，当其跳跃范围超出光谱扫描范围时，实验结果中并不能区分是否为光谱跳跃还是其它的闪烁过程。为了对光谱跳跃进行动力学研究，人们往往固定激发光频率，检测荧光分子荧光强度的变化，对于该荧光强度动力学的分析不经可以得到其跳跃速率，同时可以通过改变实验条件如激发光强度，样品温度等来对其跳跃机制进行研究。 分子光谱扩散和跳跃现象大部分出现于多晶样品中，晶体中扰动较大，因此即使在同一个样品中，同样的温度和实验条件下，不同的分子光谱扩散的表现可能完全不同。

分子荧光的闪烁和淬灭是单分子光谱最重要的标志，荧光闪烁是指分子的荧光在连续激发的情况下会出现随机的消失，然后又恢复的过程，就像天空中星星在不停的闪烁一样。荧光淬灭则是指荧光分子的荧光发射在连续激发的情况下突然小时并且不再恢复的现象。荧光闪烁和淬灭是单分子荧光光谱研究领域中的重要发现之一。其特征往往是分子荧光从某个强度突然降为零，这种单步荧光强度的改变过程也可以从侧面反映出研究目标为单个的分子。自从荧光闪烁现象被发现后，吸引了研究者极大的兴趣，目前普遍接受的荧光闪烁解释为荧光分子通过光物理或光化学过程转变为某一个没有荧光发射的暗态。比如分子可以通过系间窜跃到达三线态，由于三线态寿命较长，分子到达三线态后将不能被激发光激发，也没有了荧光发射。其它的长寿命暗态如电荷转移态、自由基等均可能使分子发生荧光闪烁现象。如果分子发生了化学氧化或者光氧化等不可恢复过程，则分子表现为荧光淬灭过程。低温下分子闪烁除了上述原因之外还有一个可能是分子的光谱发生了移动，也就是上一节所说的光谱扩散。当分子的光谱移动到另一个频率（大于分子线宽）后，固定频率的激发光不能再激发该分子，如果光谱移动回原位置，则分子再次被激发而发射荧光，产生闪烁现象。如果光谱移动之后不再回到原来的位置，则分子表现为淬灭现象。但此时分子并非一定是发生化学反应被淬灭，也有可能是周围环境发生变化导致的。分子的荧光闪烁往往不利于单分子荧光性质研究，因为其强度不停变化，而且这种不稳定性对于分子的跟踪和连续动力学研究都造成一定困难。同时具有荧光闪烁的分子往往相对来说更加不稳定，等容易发生荧光淬灭现象是研究者不得不中止对其荧光检测。但是从另一方面讲，分子的荧光闪烁现象也可以让研究者得到更多的信息，对荧光闪烁动力学的研究可以对分子被激发后所处的暗态性质进行研究包括其寿命，甚至跃迁速率等参数。需要强调的是近些年所发展的几种超分辨荧光成像技术，大部分都是利用荧光分子的荧光闪烁性质来实现的。