英文标题：Integrated transcriptome and proteome analysis identifies keratins as key regulators of corneal scarring in a murine model

中文标题：整合转录组和蛋白质组分析鉴定角蛋白为小鼠模型角膜瘢痕形成的关键调节因子

发表期刊：Computational and Structural Biotechnology Journal

研究思路：

图1.实验流程

[导读]

 角膜是眼屈光面的重要组成部分，它为视网膜成像提供了最重要的屈光能力，也保护了眼内组织免受外部损伤。当角膜受伤之后，人体会启动复杂的角膜基质再生过程，而在基质再生的过程中，很有可能因为再分化的细胞纤维化发展导致了角膜瘢痕的形成和不可逆的视力受损。目前，眼角膜损伤只能通过眼角膜手术进行治疗，而这项工作可能为眼角膜的药物治疗实现突破。

 上海市第九人民医院眼科团队联合纽科生物对受损的小鼠角膜细胞进行了高通量测序，之后通过生物信息学手段结合体外实验揭示出了四个重要的角蛋白基因：Krt13、Krt14、Krt17和Krt19。这项工作从基因和蛋白质表达谱层面上解释了什么有助于角膜瘢痕的形成，为治疗角膜瘢痕靶向药物开发和阐明具体分子机制奠定了重要的基础。

 在这项工作中，一开始只有病变的小鼠模型，到最后成功定位了和角膜瘢痕形成的因子，生物信息技术在其中起到了不可或缺的作用。比起传统实验，利用生物信息技术与体外实验相结合的模式让以往困难的研究变得更加的高效。如何从高通量数据中选择合适的靶点进行后续实验?本文是从表达变化至功能筛选的经典案例。

[高通量测序，迅速划定范围]

  在这项工作中，利用了受伤3周后的小鼠损伤模型，收集受伤的眼角膜组织并和对照组一起进行RNA测序和串联质量标签（TMT）蛋白质组学分析，并从中检测到420个差异表达基因（DEGs）和463个差异表达蛋白（DEPs）。其中总共有54个因子在基因和蛋白质水平同时受到调控，具体表现为在转录和翻译水平表现出一致的表达模式。

 在该项目的分析中，充分利用了多组学联合分析的优势，快速精确地分析了细胞中的每一个基因的表达水平，找到了所有可能影响到角膜瘢痕形成的因子，为接下来进行精确分析缩小了范围，节约了大量的筛选成本。

图2.病变眼角膜组织的差异性位点

[功能富集分析，再度缩小范围]

 通过高通量测序，已经成功从成千上万个基因中找到了相关的54个因子，但对于体外实验而言，逐一验证依然需要高昂的成本。为了解决这个问题，对这54个因子进行了功能富集分析，再度缩小相关的范围。

 在这项工作中，通过GO分析和KEGG分析，结合相关的生物学术语及富集度，将54个因子的范围再度缩小，最终划定了22个关键因子，这些就是最有可能和角膜瘢痕直接相关联的因子。

 图3. 对54个关键因子的GO分析（仅显示前20个）

[蛋白互作网络，精确定位“枢纽因子”]

在团队找到的22个关键因子中，这些因子的作用各不相同，而生物信息技术除了将它们挑选出来之外，还可以将它们的主次之分作出排列，而这就需要蛋白互作网络分析（PPI）。

 通过算法，对这22个关键因子进行了进一步的筛选并建立了PPI网络，如图4所示。每一条横线都代表了蛋白之间的相互作用，经过生物信息技术处理后肉眼可见的就可以看到一个相互影响的蛋白互作枢纽，分别由Krt13，Krt14，Krt17，Krt19组成。这些“枢纽因子”，很有可能就是直接影响到角膜瘢痕形成的关键调控因子。到此为止，生物信息技术将最关键的因子从无数因子当中精准的挑选出来，接着就是进行体外实验来验证生物信息技术得到的结果。

图4. 22个关键因子经算法形成的PPI网络

[体外实验，理论与实践相结合]

 根据理论结果，接着对四个“枢纽因子”的表达水平进行了检测。免疫荧光结果显示，这些因子在瘢痕角膜上皮中的表达均有显著增强，同时发现了Krt13能够促进角膜上皮细胞的上皮-间充质转化（EMT）。这些发现与生物信息技术得到的理论结果相吻合，揭示了这些因子在角膜瘢痕的形成中有着重要作用。

图5. 枢纽因子在小鼠模型的表达

 [总结]

这项工作成功揭示了四个眼角膜瘢痕形成的关键因子，揭示了角膜瘢痕形成的潜在通路，为进一步的分子机制研究和理论机理研究打下了坚实的基础，同时也提出了一个新的靶向药物的开发靶点，为将来通过药物治疗眼角膜损伤疾病提供一个可能，而不是仅仅受限于手术治疗。

 这项研究将生物信息技术和传统实验结合起来，通过生物信息技术，快速精准的定位到靶向目标，得到一个理论结果，为传统实验提供指导。依靠生物信息技术，传统实验不必像以往一样大海捞针，可以轻松根据理论指导得到一个理想的实验结果，从而实现短时间快速平稳的得到科研上的成果。

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