The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation

XJJ

细胞焦亡（pyroptosis）

Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018

Major cell death subroutines. Mammalian cells exposed to unrecoverable  perturbations of the intracellular or extracellular microenvironment can activate one of many signal transduction cascades ultimately leading to their demise. Each of such regulated cell death (RCD) modes is  initiated and propagated by molecular mechanisms that exhibit a  considerable degree of interconnectivity. Moreover, each type of RCD can manifest with an entire spectrum of morphological features ranging from fully necrotic to fully apoptotic (完全坏死至完全凋亡), and an immunomodulatory profile  ranging from anti-inflammatory and tolerogenic to pro-inflammatory and  immunogenic. ADCD: autophagy-dependent自噬依赖性 cell death, ICD: immunogenic cell death, LDCD: lysosome-dependent 溶酶体依赖性cell death, MPT: mitochondrial permeability transition 线粒体通透性转变.

Ø根据形态学特征以及对caspase1的严格需求，被定义为“caspase1依赖性细胞坏死（ caspase 1-dependent necrosis ）”

Ø根据其发生时并发的炎症效应，细胞焦亡被重新定义为“炎性小体依赖性的细胞死亡（ an inflammasome-dependent cell death and an effector mechanism of the inflammasome ）”

Ø由于gasdermin在细胞焦亡中的作用，因此将其定义为“gasdermin诱导的细胞死亡和坏死（ gasdermin-induced necrotic cell death ）”，适用于所有通过改变膜透性导致细胞死亡的gasdermin家族成员

Ø发生焦亡的细胞的特征：广泛的膜起泡，然后膜膨胀，最终由于渗透裂解失去膜的完整性，导致细胞死亡、细胞内容物的释放，并引起剧烈的炎症反应。

Feng Shao：国家生物科学研究所

Pablo Pelegrín：穆尔西亚大学临床医院/穆尔西亚生物医学研究所，西班牙

Petr Broz：洛桑大学生物化学系，瑞士

主要内容：

•Gastermins蛋白的激活

•Gastermins诱导细胞膜孔隙形成的机制

•Gastermins蛋白诱导的细胞膜通透性变化而引起的生物学功能

Gastermins蛋白家族的介绍

•在胃肠道（gastrointestinal）中高表达，同时在皮肤（skin）中也有较低的表达水平

•局限于食道（esophagus）和胃（stomach）中高表达，但在胃癌细胞中受抑制

•根据表达模式命名为“Gastermins（Gsdm）

a | Phylogenetic tree showing divergence of the human, mouse and rat  gasdermin proteins. The human gasdermin protein (GSDM) family is encoded by six genes whose overall sequence similarity ranges from 23.9 to  49.4%. These can be further subdivided, as GSDME and pejvakin (PJVK)  also belong to the deafness-associated genes (DFN) and their protein  sequences cluster together, distant from the other human gasdermins  (GSDMA–GSDMD). Evolutionarily, GSDME and PJVK are the most ancient  gasdermin members, with similar sequences found in lower vertebrates and in some invertebrates124,125, but not in worms and flies (P.B., P.P. and F.S., unpublished data). GSDMA gene sequences are found in mammals as well as in birds and reptiles, whereas GSDMB, GSDMC and GSDMD genes are exclusively present in mammalian genomes and are closely related to GSDMA, indicating that they arose through gene duplication125. Mice and rats lack Gsdmb, but mice feature three GSDMA homologues (Gsdma1–Gsdma3) and four GSDMC homologues (Gsdmc1–Gsdmc4) in addition to Gsdmd, Gsdme and Pjvk15. Structurally, gasdermins consist of two distinct domains connected by a flexible linker, except for PJVK that presents a smaller C-terminal  domain (CT). The N-terminal gasdermin (GSDMNT) domain  displays the highest sequence similarity among all family members  (similarity ranging from 28.8 to 50.5%). By contrast, the C-terminal  gasdermin (GSDMCT) domain presents variable lengths and lower similarity (ranging from 1.3 to 46.3%)7,8 (Supplementary Figure 1). GSDMNT harbours the intrinsic pore-forming/pyroptosis-inducing activity, whereas GSDMCT interacts with GSDMNT and thereby inhibits its activity in the absence of an activating signal7,8,16. The scale indicates the number of substitutions for each amino acid in  the sequence. Phylogenetic tree generated from UniProt sequences by the  European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) Clustal Omega tool and  drawn by FigTree software version 1.4.3. b | Domain structure of  human GSDMD and GSDME featuring caspase cleavage sequences in the linker (top) and the structure of the membrane inserted N-terminal domain (NT; bottom). α1, first α-helix that specifically interacts with  phospholipids; β1–β4, four parallel β-strands that insert into the  membrane; H. sapiens, Homo sapiens; M. musculus, Mus musculus; R. norvegicus, Rattus norvegicus.

Gastermins家族蛋白主要由6个序列相似的基因编码：

•其中GSDMC和 GSDMD仅存在于哺乳动物中；GSDMA在鸟类和爬行动物中也有；小鼠缺乏GSDMB

结构上，gasdermin家族蛋白由两个domain组成，二者由柔性接头连接：

•N端domain具有细胞毒性（ intrinsic pore-forming/pyroptosis-inducing activity），不同成员的N端序列具有较高的相似性

•C端domain具有抑制性，结构域长度可变，相似性较低

Ø当C端缺失的GSDME蛋白在人类细胞中表达时，会导致细胞死亡，从而引起听力损失

Ø当GSDME的剪接突变体在酵母中表达时，会导致细胞周期停止，从而诱导细胞的死亡

Gasdermin蛋白的N端和C端相互作用，使得gasdermin蛋白处于自抑制状态。如果这种相互作用被破坏，C端的抑制性被解除，就会激活N端的细胞毒性，诱导炎症反正和细胞死亡。

Gastermins蛋白的激活

•经典的炎性小体通路

•非经典的炎性小体通路

•细胞凋亡时激活的caspase激活gasdermin蛋白

•中性粒细胞中的ELANE蛋白裂解并激活gasdermin蛋白

•C端突变/自抑制结构破坏激活gasdermin蛋白

Ø中性粒细胞中的ELANE蛋白裂解并激活gasdermin蛋白

•中性粒细胞中GSDMD的裂解是由中性粒细胞弹性蛋白酶（ELANE）介导的；

•GSDMD是中性粒细胞死亡的关键调节因子；

•gsdmd缺陷的小鼠可以延迟中性粒细胞死亡，导致增强宿主防御；

•gsdmd缺陷的小鼠对大肠杆菌的杀菌活性增强。

ØC**端突变/自抑制结构破坏诱导Gasdermin蛋白激活

即使gasdermin不被裂解，当C端发生突变或者翻译后修饰时，C端和N端之间的自抑制作用被破坏，从而激发gasdermin的细胞毒性作用，而引起细胞焦亡。

Gastermins诱导孔隙形成的机制

•在N端，位于β折叠的凹面的α1螺旋和β发夹与C端结构域密切相互作用；

•N端片段靶向带有负电荷的磷脂，并插入膜中，构象发生剧烈的变化，继而形成gasdermin孔隙；

•每个GSDMA3孔包含约26-28个N端原聚体，内径约18 nm，外径约28 nm。GSDMD孔隙的异质性较大，内径在10 ~ 20nm之间（可能由于信号/环境不同） ；

•gasdermin家族的不同成员有共同的膜靶向机制，都能较好地靶向磷酸肌醇和心磷脂，或较弱地结合磷脂酸和磷脂酰丝氨酸；

•鞘磷脂的可极大地促进N端片段与脂质体的结合，而胆固醇进入脂膜显著地降低与N端片段的关联；

•全长GSDMB与GSDMB的N端有相似的脂质结合能力，这表明C端并不妨碍它的脂质结合。

•N端片段（P30）定位于脂质双分子层，而C端（P20）位于水相。

•GSDMA3和GSDME与GSDMD相似，通过与膜上的脂质相结合，形成GSDM孔隙，从而诱导细胞焦亡。

Gastermins蛋白介导的细胞焦亡的生物学功能

•Gasdermin孔隙可作为细胞内分子释放的通道

•Gasdermin细胞焦亡的免疫学功能

•Gasdermin蛋白在疾病中的作用

•Gasdermin蛋白的抑制和治疗

Ø孔隙功能：

•钾离子释放，触发NLRP3炎性小体的激活

•IL-1、IL-1β等细胞因子释放

•小分子蛋白，如GTPases的释放

•

Ø膜修复诱导的囊泡释放：

•ESCRT可以移除gasdermin孔隙，从而阻止钙离子的内流，并促进含有受损膜的小泡的出芽和释放

•

Ø膜裂解后被动释放：

•细胞裂解后，细胞内容物的释放

•发生焦亡的细胞的特征：广泛的膜起泡，然后膜膨胀，最终由于渗透裂解而失去膜的完整性，而导致细胞死亡。

•如果孔隙被修复，细胞内分子短暂的释放，并且释放的是可以通过孔隙的小分子；

•如果质膜上的孔隙不被修复，细胞内大分子如炎性小体复合物将会被释放，导致比较严重的炎性反应。

•GSDMDNT与心磷脂结合，并靶向线粒体膜，增强活性氧的产生。在中性粒细胞中，GSDMDNT与细胞膜结合并将其破坏。

•而GSDMA3NT也能破坏线粒体，诱导线粒体自噬。

Gasdermin蛋白在疾病中的作用

**

Gasdermin A：

•GSDMA在胃肠道和皮肤中表达升高，但在原发性胃癌和胃癌细胞系中表达抑制；

•在培养细胞中，GSDMA3的N端片段可以通过改变质膜通透性诱导细胞死亡，C端的表达则可以抑制该过程；

•GSDMA3的突变与皮肤相关的表型有关，突变破坏了自抑制作用，诱导细胞焦亡；

•GSDMA过表达的细胞中，线粒体活性降低。

Gasdermin B：

•GSDMB参与肿瘤进展，在胃癌、宫颈癌、乳腺癌和肝癌中表达上升，导致预后不良、生存率低并转移率增加；

•GSDMB2与乳腺癌细胞的致瘤性和转移密切相关；

•GSDMB的单核苷酸多态性与疾病易感性增加相关，如哮喘和溃疡性结肠炎；

•GSDMB可以转运磺胺，其单核苷酸多态性可导致结构改变，从而影响细胞内磺胺的水平；

•GSDMB的剪接变异会导致丢失caspase1的裂解位点，影响诱导气管上皮细胞焦亡的能力，与哮喘有关。

Gasdermin C：

•GSDMC在转移性黑色素瘤细胞中高表达；

•GSDMC有促肿瘤作用，下调GSDMC可减少结直肠癌细胞系的增殖；

•GSDMC在食管鳞状细胞癌中的表达被抑制。

Gasdermin D：

•GSDMD是非经典炎性小体通路中下游细胞死亡的唯一执行器，但在经典炎性小体激活后，GSDMD的缺失并不能完全阻止细胞死亡；

•GSDMD缺失的小鼠，对肠道沙门氏菌感染的敏感性增加，且不易感染Francisella novicida；

•GSDMD缺失的小鼠，对脂多糖诱导的细胞致死性有保护作用；

•GSDMD缺失的小鼠，可以消除炎性疾病相关的炎症症状；

•GSDMD缺失的动物，可以在特定环境下，扮演一个环境依赖的、可选择的细胞死亡通路，来保护细胞在经典炎症小体激活后免受微生物的侵扰。

Gasdermin E：

•GSDME与人类非综合性听力损失相关；

•所有已知的GSDME的突变都会导致第8个外显子跳跃，从而产生一个具有细胞毒性的蛋白；

•激活caspase3的药物，在GSDME高表达的细胞中诱导炎性细胞死亡，在GSDME阴性的细胞中诱导凋亡；

•GSDME可能对化疗的副作用有更强的抵抗力；

•GSDME以特定细胞类型的方式将凋亡转化为焦亡而导致细胞死亡。

Pejvakin：

•PJVK可能不会有抑制性结构域，与gasdermin家族其它成员没有明显的同源性；

•PJVK位于内毛细胞中过氧化物酶体的膜上，直接招募自噬蛋白LC3B，以介导损伤的过氧化物酶体的自噬作用，从而保护听觉相关细胞免受氧化损伤；

•PJVK的突变，会引起外毛细胞功能失调，从而损害人和小鼠的听力；

•PJVK缺失的小鼠，听力受到损害，表现出抗氧化防御受损的现象；

Gasdermin**蛋白的抑制和治疗**

因为GSDMD在炎性小体诱导的细胞死亡和细胞因子释放中的作用，所以已知的gasdermin孔隙的形成可以作为抗炎治疗的靶点。

Ø化合物，如Punicalagin：

•一种在石榴中发现的抗氧化多酚；

•可以阻止焦亡和IL-1β的释放；

•通过阻碍质膜的流动性，干扰gasdermin孔隙的形成；

•在刺激前，应用gasdermin可能会干扰细菌炎症小体激活物的细胞传递。

Ø金属离子，如La3+和Gd3+：

•抑制巨噬细胞焦亡前质膜上的孔隙的形成，从而阻断细胞裂解；

Ø药物，如NSA：

•直接靶向GSDMD，共价修改GSDMD的Cys191，从而抑制人和小鼠细胞的焦亡；

•阻断炎症小体激活时的质膜通透性和IL-1β的释放，保护小鼠免受LPS介导的感染性休克。

ØGasdermin**家族蛋白包含6个成员，分别是GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和PJVK**

ØGasdermin**被激活的机制：**

•蛋白酶（**caspase/ELANE）水解柔性链接**

•C**端突变破坏自抑制结构**

ØGasdermin**被激活后，N端片段靶向质膜中带负电荷的脂质，插入质膜中，诱导孔隙形成**

ØGasdermin**形成孔隙后，可作为通道释放细胞内分子，也可诱导细胞焦亡**

ØGasdermin**蛋白的激活及其下游作用与多种疾病相关，也可作为药物靶点用于疾病的治疗**

•

•不同细胞中gasdermin**被激活的机制是否有规律？

•不同的gasdermin**成员拥有不同的生物学功能

•是否所有的gasdermin都具有炎症和防御微生物感染的功能？