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关于生物制品工艺验证的审评实践与思考
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关于生物制品工艺验证的审评实践与思考
摘要：有效的工艺验证是药品质量的重要保证。由于生物制品来源于细胞基质、制备工艺复杂，具备结构表征不完全等特点，生物制品的工艺验证需进行特殊考虑。本文根据国内外相关指导原则并结合药品审评工作实践，总结了生物制品工艺验证中关于细胞基质、发酵与纯化过程、病毒安全性、层析介质寿命与一次性反应器耗材，以及中间体稳定性等的一般要求。同时，就目前国内生物制品注册管理中出现的共性问题进行探讨。
关键词：生物制品；工艺验证；过程开发；过程表征；工艺确认
The general points to consider and discussion ofbiologics process validation
Abstract: Effective process validationcontributes significantly to assuring drug quality. Due to derived from livingsubstrate, complexity of manufacturing process and not-well characterization ofmolecular structure, some specific points to consider for process validation ofbiologics were required. In this review, the general issues related tobiologics process validation was summarized, including cell substrate, viralsafety, fermentation and purify process, single used bioreactor, chromatographylife, and stability and holding time of intermediate. Moreover, the common problemsrelated regulatory submission of process validation data were also discussed.
Key words: Biologics; Process validation； Process development；Process characterization; Process verify;
前言
工艺验证（Process validation）是指证明生产工艺按照规定的生产参数能够持续、稳定的生产出符合预定用途和注册要求的产品[1]。药品的临床有效性与安全性依赖于其产品质量属性。按照“质量源于设计”（Quality by Design，QbD）的理念，保证终端产品质量不仅依赖质量标准和产品检验，更依赖于工艺设计与过程验证[2]。工艺设计存在缺陷的药品，即使通过终端检验也无法保证工艺持续生产出合格的产品。基于上述先进理念，药学研发与评价的侧重点已从多年前的质量标准研究逐步转移到工艺过程的研究及评估[3]。
生物制品主要包括人用疫苗、重组DNA蛋白、重组单克隆抗体、血液制品和组织提取物等。与小分子化学药物相比，生物制品来源基质为细胞、微生物、血液、组织和体液等，其生产制备工艺较为复杂，且按照目前分析手段其分子结构尚不能完全表征。因此，为保证生物制品的质量一致性，生产工艺的设计、确认与验证就显得尤为重要。本文首先介绍了工艺验证概念的发展与最新要求，结合生物制品自身特点，重点总结了生物制品工艺验证过程中的特殊考虑。最后，从药品审评的角度，就目前生物制品注册管理中出现的共性问题展开讨论。
一、工艺验证的概念与实施
1.1 工艺验证的概念发展与相关要求
1987年美国FDA率先颁布了《工艺验证指南》，最早提出了工艺验证的概念与实施方法。此后，随着行业技术的发展，风险控制以及QbD等先进理念的应用，2011年美国FDA发布了新的《工艺验证指南》，引入了“产品生命周期”概念强调工艺验证的科学性、系统性以及可持续性。并且，将工艺验证划分为三个阶段，即：工艺设计（Process Design）、工艺确认（ProcessQualification）和工艺的持续保证（Continued Process Verification）[2]。此后，2012年欧盟EMEA颁布了《工艺验证指南》，指出工艺验证的方法可采取传统工艺验证、持续的工艺核实或者两者混合的办法等进行实施[4]。2016年，欧盟EMEA又针对生物制品上市和工艺变更的注册要求，提出了生物制品原料药工艺验证的内容及具体要求。其中对上游工艺、下游工艺、多厂家生产、返工等涉及的工艺验证提出了具体的要求。[5]
我国2010版《药品生产质量管理规范》中关于工艺验证的相关要求集中体现在第七章（确证与验证）中，其中明确工艺验证应包括首次验证、影响产品质量的重大变更后的验证、必要的再验证以及在产品生命周期中的持续工艺确认，以确保工艺始终处于验证状态。具体条文如：“工艺验证应当证明一个生产工艺按照规定的工艺参数能够持续生产出符合预定用途和注册要求的产品”；“采用新的生产处方或生产工艺前，应当验证其常规生产的适用性”；“确认和验证不是一次性的行为。首次确认或验证后，应当根据产品质量回顾分析情况进行再确认或再验证。关键的生产工艺和操作规程应当定期进行再验证，确保其能够达到预期结果”等[1]。
此外，根据现行《药品注册管理办法》，对于首次注册生产的药品，在通过技术审评后还应对拟商业规模的生产过程进行现场检查，同时进行抽取样品进行检验，以确认生产工艺的可行性。药审中心将结合技术审评意见、样品生产现场检查报告和样品检验结果综合评价[6]。因此，进行拟商业化生产规模的工艺验证也是决定药品能否上市的必要条件之一。
1.2 工艺验证的实施与方法
工艺验证的实施应围绕生产工艺和产品的认识进行展开。按照FDA最新颁布的《工艺验证指南》，可按照工艺设计、工艺确认和持续的工艺核实等分阶段进行实施[2]。工艺设计阶段应基于开发和中试生产中获得的知识，建立生产工艺设计空间和控制策略；工艺确认是对工艺设计进行评估，以确定工艺是否具有重复商业化生产的能力；持续工艺确认是为了确保在商业化生持续处于可控状态，在产品上市后通过收集和评价关于工艺性能的信息和数据，评估工艺变化情况。
工艺设计阶为了考察工艺参数（输入）与产品质量（输出）之间的关系，为建立设计空间和生产控制策略提供科学依据，一般可利用小型设备采用DOE（Designof Experiments）实验设计进行考察。如：培养工艺开发中采用摇瓶、转罐（Spintube）或小型发酵罐同时对多种发酵工艺参数（培养基、温度、pH及溶氧等）进行优化[7,8]；纯化工艺开发过程中采用96孔板（PreDictor plate96）高通量筛选色谱介质或缓冲液[9]；
工艺确认阶段是对拟商业化工艺在cGMP条件下进行确认，证明产品上市后可以稳定重现的生产出具有质量一致性的产品。商业化生产工艺确认应包括两个要素，分别是厂房设计、设备与设施的确认以及工艺性能确认（processperformance qualification，PPQ），PPQ是采用已完成确认的厂房、设备和设施，由经过培训的人员按照商业化生产工艺、控制程序等进行商业化产品的生产过程。因此，生物制品注册临床试验时，连续三批临床样品的中试生产尚不能成为严格意义上的工艺确认。工艺确认是指生物制品报产前要求在cGMP条件下进行连续三批拟上市规模的生产。通过此阶段的工艺参数、中控指标和产品质量可最终确认商业化工艺的稳健性（Robust）。
工艺的持续验证是指产品上市后，为了确保生产工艺始终处于可控状态所进行的持续监控。生物制品注册生产后，应继续收集并分析多批次商业化生产数据。这样既可以保证上市产品的质量可控性，又为后续发生工艺变更、提高产品质量提供“可比性”研究数据支持。
二、生物制品工艺验证的特殊考虑
与传统小分子化药相比，生物制品的生产工艺具备如下特点：（1）产品来源于活的细胞基质或生物源性的物质；（2）生产工艺涉及复杂的多工序步骤；（3）产品分子结构复杂，结构确证具有一定的不完全性，同时强调生物活性的重要性。如：治疗性重组单抗一般采用哺乳动物细胞表达，经动物细胞培养，多步层析纯化制成冻干或液体制剂。IgG型抗体理论上存在的变体形式至少有108种[9]；而预防性疫苗情况更为复杂，一般为完整的病原体或病原体组分，加之与佐剂配伍及相互作用。目前多数的预防性疫苗尚不能进行完整的结构确证[10]。
因此，生物制品的工艺验证应结合生物制品的工艺复杂性和产品变异性进行特殊考虑。如：对于生产工艺涉及具有病毒安全性风险的细胞基质、体液、组织或血液，工艺验证应考虑细胞基质的病毒灭活；对于采用连续传代工程细胞表达的重组蛋白，工艺验证应考虑工程细胞株的传代稳定性；对于纯化工艺采用多步骤工序的生物制品，下游工艺验证应考虑对产品相关杂质和工艺相关杂质的残留或去除；对于终端产品含有多种形式变体的生物制品，工艺验证应采用先进的表征手段尽可能的提供结构确证信息，等。
2.1关于生产细胞基质的验证
多数预防或治疗类的生物制品，产品来源于活的细胞基质。如：疫苗的生产基质主要采用原代细胞（地鼠肾细胞、猴肾细胞、鸡胚细胞等）、二倍体细胞和传代细胞（Vero）[10]。治疗用重组蛋白一般采用哺乳动物细胞（CHO、SP2/0，NS0等）异源分泌表达[11]；治疗用细胞治疗产品则来源于患者的自体细胞。因此，为保证产品的安全性和质量一致性，应对生物制品工艺涉及的细胞基质进行充分验证。
按照2015版中国药典要求，生产细胞应严格按照多级种子库（主细胞库、工作细胞库）管理，并且应对主细胞库、工作细胞库、生产终末期细胞（EPC）进行全面的检定（鉴别、纯度、内/外源因子、成瘤性/致瘤型，细胞核型等）。一般主细胞库应进行全面检定；工作细胞库的外源因子检测，应重点考虑从主细胞库到工作细胞库传代过程中可能引入的病毒。如细胞库传代或建库过程中使用了动物源性原料（猪胰酶或牛血清），细胞库还应检测猪/牛源型病毒。对于已经证明具有成瘤性的传代细胞（CHO，NS0，HEK293，BHK21等）用于生产治疗性生物制品生产时，可不再进行细胞致瘤性检查。国内申报临床试验阶段一般要求提供终末生产细胞（EPC）的检定。如临床试验阶段发生培养工艺变更，需重新进行EPC细胞检定[12]。
此外，为保证终端产品质量的一致性，工程细胞在生产中应实行有限代次传代，其传代次数应经过遗传稳定性实验验证。即，遗传稳定性研究所覆盖的代次应大于商业化规模生产中最大的传代次数。一般工作细胞在模拟真实生产工艺下，采用小型生物反应器进行连续传代培养。稳定性考察的指标也应包括生产细胞的基因型（目的基因序列、基因拷贝数、整合位点等）和表型（活率、代谢、目的产物滴度等）[13]。
2.2关于发酵与纯化工艺的验证
生物制品原液生产工艺一般分为以细胞发酵为主上游工艺，和以多步纯化工序为主的下游工艺。对于原液的工艺表征研究，应说明各工序操作操作参数的合理性，并建立必要的中控验收标准。细胞培养工艺的研究与验证应关注：操作条件对细胞生长特性、代谢水平和目的产物的影响。并且，应需根据最大传代代次、微生物污染或产品质量建立发酵液废弃指标，如无菌、支原体、特异性病毒、目的产物产量等。
下游纯化工艺的研究与验证，应关注关键工序对于产品相关杂质（聚体、降解产物、电荷异构体、疏水变体等）、工艺相关杂质（宿主蛋白、宿主DNA、脱落配基、内毒素、抗生素等）可有效去除或残留水平[14]。对于化学偶联修饰的制品（化学偶联抗体药物、化学修饰多肽类药物等），工艺验证还应重点关注对游离修饰基团、非偶联蛋白比例等的过程控制。对于预防性疫苗下游工艺中，应重点对有效抗原的提取和杂质去除进行验证[15]。
2.3关于病毒安全性的工艺验证
对于生物技术产品，细胞基质以及部分生产原材料（胰酶、血清）等均存在病毒污染的风险。而且，由于CHO、SP2/0等细胞基因组中含有逆转录病毒颗粒，因此，生物制品的病毒安全性工艺验证既要关注细胞基质来源、原材料，还重点考察纯化工艺中对于病毒的去除/灭活能力[16]。国内目前一般要求，生物制品进入临床试验前完成关键工序的病毒清除与灭活验证，申报生产阶段则要结合层析介质的使用寿命完成对整个工艺的病毒灭活进行验证。
病毒灭活/去除工艺验证主要采取规模缩小模型模拟实际工艺条件，对主要工序（低pH孵育、S/D处理、纳滤等）的灭活/去除效能进行验证。验证过程采用的病毒应具有代表性。如：低pH孵育可采用囊膜病毒（MuLV、VSV或PRV）作为指示病毒；膜过滤可采用细小病毒（PPV或MMV）作为指示病毒。病毒灭活的一般要求是，至少包括两个步骤对病毒去除/灭活的效果达到4log以上[16][17]。
值得关注的是，对于病毒灭活的工艺验证，既要保证对于模式病毒灭活效率，也要关注产品质量的变化。目前已经发现IgG4型抗体（如：Nivolumab）对于酸孵育过程中pH较为敏感[18]，因此，其工艺验证还应考察病毒灭活对产品质量（抗体的纯度与活性、或疫苗的抗原含量和效价等）的影响。对于灭活疫苗等传统疫苗，由于产品本身即为病毒，病毒负荷远高于生物技术产品的潜在理论值，因此其病毒灭活验证除进行灭活终点的常规灭活效果检定外，还需要在灭活过程中取样进行病毒灭活动力学曲线的研究；同时需通过研究证实，灭活后的抗原仍具备充分的免疫原性。
2.4关于层析介质、一次性反应器适用性的验证
层析工序（亲和、疏水、离子交换等）作为生物制品去除相关杂质和病毒灭活的主要工序，其处理能力和纯化效果依赖于层析介质的使用寿命。因此，一般生物制品在注册生产前，应采用规模缩小模型模拟在实际工艺条件，根据工艺性能（蛋白载量、回收率）和产品质量（纯度、工艺杂质残留）确认其使用寿命（最大使用循环数）[14]。
近年来，由于一次性反应器可避免清洁、灭菌工艺等验证成本，在细胞大规模培养得到广泛的应用。如：利用一次性生物反应器流加培养动物细胞生产重组抗体[7]，利用一次性反应器灌装培养CHO-C28细胞生产HbSAg抗原[19]。但是，考虑到一次性生物反应器材质的适用性及潜在风险，工艺验证应开展浸出物（Extractable）和提取物研究（Leachables）等研究。EMEA的相关工艺验证文件也指出，工艺开发阶段应充分一次性耗材对于考虑溶出物和提取物风险评估，采取供应商文件（溶出物数据）或采用模拟条件进行研究。工艺确认阶段，应说明一次性耗材对于生产性能（如细胞活率）、产品质量的影响[5]。
2.5中间产品、原液与制剂保存与运输验证
由于生物大分子蛋白的不稳定性，一般生物制品原液采用冷冻、制剂采用冷藏等方式进行保存与运输。按照最新颁布的《生物制品稳定性研究指导原则》的要求，原液和制剂包装选择、贮存条件、有效期、运输条件均需要通过稳定性研究（影响因素、强制降解、加速和长期等）进行验证。此外，某些生物制品的生产工艺受场地、工艺条件所限，部分中间体会在工艺的某个阶段会短暂保存（Holdingtime），如，抗体生产过程中亲和层析收液可短时间冻存或冷藏后再进行下一步处理；胰岛素生产过程中包涵体收获后进行异地加工等。此时就需要对中间品的保存条件、有效期和运输条件进行验证。[20]
三、药品注册管理中存在的共性问题
在生物制品的药学评价中，工艺验证资料是说明生产工艺的科学性、合理性和可重复性最为直接的证据。目前我国药品生产企业在注册资料申报过程中，缺乏工艺验证数据是较为常见的药学研究缺陷。注册资料中经常出现“有工艺研发无工艺验证”，“有工艺验证无工艺研发”，甚至“既无工艺研发，也无工艺验证”等问题。上述情况都造成无法通过工艺验证数据说明工艺的稳健性和产品的一致性。下文将结合审评实践，对目前国内药品注册管理中出现的工艺验证相关问题及内在原因进行讨论。
3.1、工艺研究不充分，验证批次/规模不具有代表性
由于工艺验证研究需要药品生产企业从原辅料、人员、设备设施等多方面予以保证，整个工艺验证过程的资金投入、时间成本较高。为了将研发成果经过转化生产，申请人往往会尽可能减少工艺验证批次，压缩工艺验证时间，造成工艺研究不充分、验证批次/规模不具代表性。此外，由于长期以来我国生物制品的研发已跟踪国外原研产品进行仿制为主，其生产工艺路线对借鉴原研品种或采用平台化制备工艺，这也容易造成申请人对工艺研究和工艺确认缺乏足够的重视。
工艺研究阶段对生产工艺进行全面、深入的研究，有助于认识工艺参数对产品质量的影响，进而为工艺参数的调整预留足够的设计空间。可以说，前期工艺研究越充分，产品批准上市后变更工艺的可能性也就越小。反之，就会造成了未来产品上市后不能按照制造规程进行生产或者出现重大工艺变更。
工艺确认阶段的工艺验证应采用符合cGMP规范进行研究，并尽可能考察工艺最差条件，以确认拟上市工艺的稳健性。目前，国内生产申报品种上市批次验证缺少良好全面的设计，除常规的放行检验及过程控制检验数据外，未充分考虑以下因素：生产工艺参数的代表性及挑战性试验的考虑；层析柱等设备的使用寿命研究；生产规模下终末代细胞或/和毒株的测序研究等。
3.2、缺乏对于产品“持续性”的工艺验证
目前国内外关于工艺验证的要求均指出，确认和验证不是一过性的行为，首次确认或验证后，应当根据产品质量回顾分析情况进行再确认或再验证。但是，部分药品生产企业对工艺验证的理解为申报时间“点”的验证，即仅以注册临床或注册生产的连续三批生产满足拟定的质量标准为准，缺少工艺验证全生命周期的考虑，缺少各阶段工艺及产品质量的可比性研究，尤其是上市产品与临床样品的可比性研究。
对于临床研究阶段或产品上市后发生的工艺变更，此时的工艺验证概念应结合或扩展为可比性研究。即，通过对变更前后多批次产品的批次放行检验、结构确证和稳定性研究（尤其是加速或强制降解）研究，证实工艺变更前后产品质量具有一致性。若存在质量差异或仅药学专业不能说明产品质量可比性，还应继续开展非临床、临床等可比性研究[21]。
3.3、工艺验证观念滞后，相关指导原则缺位
工艺验证的批次根据工艺复杂程度、工艺的变异水平以及对于工艺的认识程度而定。对于生物制品的工艺验证应鼓励在不同阶段使用多批次数据[22]。部分申请人对于将工艺验证狭隘的理解为注册临床阶段的三批中试生产和注册生产阶段的三批拟上市规模试生产，就其实是源于对上世纪八十年代工艺验证概念的片面理解，已经与目前所倡导的“基于药品生命周期”的工艺验证理念相悖。甚至在药品注册管理实践中，还出现上市申请阶段仍递交中试生产工艺研究资料，尚未完成商业化规模的验证等问题。这更暴露了药品研发者对于工艺验证概念缺乏必要的知识和认识。
在我国，目前关于生物制品工艺验证的相关要求分散于《药品生产质量管理规范》、《中国药典》总论、相关产品质量控制的指导原则（重组DNA制品、人用单克隆抗体、结合疫苗、多肽疫苗、疫苗产地工艺变更、血液制品病毒灭活）等文件。尚无专门的指导原则系统对生物制品的工艺验证进行要求，也是造成工业界对于生物制品工艺验证缺乏完整、深入认识的重要原因。在此方面，欧盟2016年出台的《关于生物技术来源产品工艺验证与申报资料的要求》，内容涵盖生物制品上游工艺、下游工艺、多产地加工、返工等验证要求，对于国内生物制品工艺验证具有一定的现实指导意义。
结语
工艺验证是保证生物制品上市后安全、有效，质量可控的必备条件。倡导并践行先进的工艺验证理念，有利于我国生物制药产业的长期发展。笔者认为，工业界应全面认识工艺验证带来的前期投入和未来收益。虽然工艺验证会增加企业研发成本，甚至推迟产品上市。但是工艺验证通过保证生产工艺的稳健性和灵活性，实际上是降低了产品生产成品和工艺变更的风险。从药品的生命周期看，良好的工艺验证是可以为生产企业带来持续的经济回报；对于监管方而言，应倡导先进的工艺验证理念，规范并引导工业界科学、有效的开展工艺验证研究。近年来，美国FDA和欧洲EMEA均倡导模块化的病毒验证[17]。即：不同的单抗使用相同的纯化工艺时，针对某一模块病毒验证是可以外推至其他的抗体。按照该理念国外申请临床阶段采用平台化进行验证。报产阶段再进行产品特异性的病毒去除与清除验证[9]。此外，国外拟商业化规模验证批次的产品是可以上市销售。在我国基于目前国内法规要求，报产阶段工艺验证批次产品不能上市销售。这既降低了申请人对于工艺验证积极性，也限制了工艺验证批次、规模和验证程度。因此，如何基于国内生物产业发展现状，借鉴国际上先进理念和经验，科学、有效，经济的开展生物制品工艺验证研究，值得工业界与监管界共同探讨。
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