富氢水增强布洛芬的镇痛作用并调控慢性炎性疼痛中NOX信号通路与NLRP3炎症小体

期刊：《国际分子科学杂志》（International Journal of Molecular Sciences，MDPI）｜论文类型：原创研究（动物实验）

作者：Giovanna Schiavoni、Weitao Wang、Sylmara Esther Negrini‑Ferrari、Olga Pol（通讯作者）——圣保禄研究所分子神经药理学研究组、巴塞罗那自治大学神经科学研究所，西班牙巴塞罗那

时间线：收稿2026‑08‑19；修改2026‑09‑06；录用2026‑09‑09；发表2026‑09‑11｜版权：©2026 作者，MDPI发行，开放获取（CC BY许可）

摘要

慢性炎性疼痛由持续氧化应激与炎症信号维持，这些信号会促进外周和中枢敏化。布洛芬等非甾体抗炎药（NSAIDs）虽是一线治疗药物，但长期使用会受剂量依赖性不良反应限制。因此，开发可提升非甾体抗炎药疗效、同时维持良好安全性的治疗策略，具有重要临床价值。

本研究采用弗氏完全佐剂（CFA）诱导雄性C57BL/6J小鼠建立慢性炎性疼痛模型，探究富氢水（HRW）能否增强布洛芬的镇痛效果。量效研究结果表明：富氢水与布洛芬均可显著缓解机械性异常痛与热痛觉过敏。值得关注的是，低剂量富氢水联合布洛芬给药，产生的抗异常痛、抗痛觉过敏效果显著优于两种药物单独使用。

分子分析显示：联合给药能够降低小鼠爪部氧化应激标志物4‑羟基壬烯醛（4‑HNE）、炎症小体组分NLRP3的表达，同时下调脊髓中NADPH氧化酶（NOX）亚型NOX1、NOX4的表达；并且能够保留CFA诱导上调的血红素氧合酶‑1（HO‑1）、超氧化物歧化酶‑1（SOD‑1）蛋白水平，而脊髓NOX2表达未发生改变。

上述结果提示，富氢水联合布洛芬产生的增强镇痛效应，与在外周及（或）脊髓层面协同调控氧化应激、炎症通路相关。综上，本研究结果支持富氢水具备作为辅助手段提升非甾体抗炎药镇痛效果的潜力，也为该联合方案作为慢性炎性疼痛多模式治疗策略开展进一步机制研究与转化研究提供充分的临床前依据。

关键词

分子氢；布洛芬；非甾体抗炎药；慢性炎性疼痛；氧化应激；NLRP3炎症小体；NADPH氧化酶

1 引言

慢性疼痛是复杂的致残性病症，疼痛持续存在，往往难以控制。布洛芬这类非甾体抗炎药凭借明确的抗炎、镇痛特性，被广泛用于慢性疼痛管理。但长期服用非甾体抗炎药会带来显著副作用，包括胃肠道毒性、肾毒性与心血管毒性。因此，研发既能实现有效镇痛、又能减少不良反应的替代或辅助治疗手段，是亟待解决的临床需求。

慢性炎性疼痛是免疫系统、神经系统、胞内分子信号通路复杂交互作用的结果。其中转录因子核因子κB（NF‑κB）的激活是关键机制，它可促进NLRP3炎症小体各组分的启动与转录上调。NLRP3是胞质多蛋白复合物的核心组分，负责白介素‑1β（IL‑1β）的成熟与释放。该促炎细胞因子结合感觉神经元受体后，会升高离子通道通透性、降低动作电位阈值，诱发神经元过度兴奋；进而驱动外周、中枢敏化，造成慢性炎性疼痛特征性的异常痛与痛觉过敏。

除炎症之外，氧化应激在慢性疼痛发病机制中同样扮演关键角色。炎症组织会生成大量活性氧（ROS），引发脂质过氧化，生成4‑羟基壬烯醛（4‑HNE）这类毒性醛类物质。4‑HNE可与细胞蛋白形成加合物，破坏细胞膜完整性，进一步加重神经元敏化与伤害性信号传导。机体为对抗氧化损伤会激活内源性抗氧化防御通路，其中核因子E2相关因子2（Nrf2）通路尤为重要。Nrf2可诱导细胞保护酶表达：包括具有抗氧化、抗炎作用、参与慢性疼痛调控的血红素氧合酶‑1（HO‑1）；以及催化超氧自由基转化为低活性物质、减轻活性氧介导组织损伤的超氧化物歧化酶‑1（SOD‑1）。Nrf2的激活还可以抑制NF‑κB等促炎信号通路，继而限制NLRP3炎症小体组装与细胞因子释放。上述分子作用有助于减轻神经元过度兴奋与中枢敏化，而这两点正是慢性疼痛发生与维持的核心环节。

NADPH氧化酶（NOX）是活性氧的主要酶促来源，越来越多证据表明，NOX通过促进氧化应激、神经炎症以及外周与中枢敏化，成为慢性疼痛的关键介导分子。NOX家族中NOX1、NOX2、NOX4三种亚型参与慢性疼痛机制：现有证据显示NOX1主要参与炎性疼痛；NOX2、NOX4更多参与神经病理性疼痛。敲除Nox1基因，或使用选择性抑制剂ML171进行药理抑制，可显著减轻多种炎性疼痛模型（福尔马林、角叉菜胶致痛模型）动物的伤害性行为。另外，表达NOX2的巨噬细胞产生的活性氧可以激活TRPA1，继而激活施万细胞的NOX1，放大外周敏化效应。尽管NOX4既往主要和神经病理性疼痛关联，但新证据表明NOX4表达变化同样参与炎性疼痛，其可通过NOX4/JAK2/STAT3/NLRP3通路促进脊髓小胶质细胞活化。

分子氢（H₂）可减轻氧化应激与炎症，能够透过血脑屏障，安全性高、不良反应极少，作为新型慢性疼痛治疗手段受到越来越多关注。在多个慢性疼痛临床前模型中，分子氢可降低4‑HNE等脂质过氧化产物水平，下调NLRP3等炎症标志物表达，通过调控氧化、炎症通路发挥镇痛作用。基于上述背景，本研究提出假说：富氢水凭借抗炎抗氧化特性，与布洛芬联用时可发挥保护效应，二者联用镇痛效果优于单药。

本研究采用小鼠足底注射弗氏完全佐剂（CFA）构建慢性炎性疼痛模型，探究腹腔注射富氢水是否可以增强布洛芬的镇痛效果。具体评估富氢水、布洛芬单药的量效关系；评价二者联合给药对机械性异常痛、热痛觉过敏的疗效；检测爪组织氧化应激标志物（4‑HNE、HO‑1、SOD‑1）与炎症标志物NLRP3的改变；同时检测脊髓组织NOX1、NOX2、NOX4蛋白水平，判断联合给药是否调控参与慢性疼痛的NOX亚型。

2 结果

2.1 CFA诱导机械性异常痛与热痛觉过敏

足底注射CFA 14天后检测伤害感受反应，验证炎性疼痛模型构建成功。与既往文献一致，CFA注射造成单侧伤害敏感性显著升高，出现机械性异常痛、热痛觉过敏（图1，见原文PDF）。

结果显示：与对侧爪相比，CFA注射侧（同侧）爪机械缩足阈值显著下降，提示出现机械性异常痛；注射CFA小鼠同侧爪热缩足潜伏期较对侧爪明显缩短，提示发生热痛觉过敏（配对t检验，p<0.001）。上述结果证实持续性炎性疼痛模型构建成功，可用于评价富氢水、布洛芬单独及联合使用的镇痛效果。

2.2 富氢水、布洛芬对CFA诱导异常痛、痛觉过敏的量效关系

腹腔注射富氢水（0.018‑0.150 μmol），可剂量依赖性减轻CFA炎性疼痛小鼠的机械性异常痛、热痛觉过敏（图2，见原文PDF）。

重复测量双因素方差分析提示，富氢水剂量、爪子（同侧/对侧）均存在显著主效应，且剂量‑爪子交互作用显著（机械异常痛：剂量p<0.0021；爪子p<0.0001；交互p<0.0001；热痛觉过敏全部p<0.0001）。Sidak多重比较显示：与CFA生理盐水组相比，富氢水处理后小鼠同侧爪最大可能效应百分比（%MPE）显著升高；0.036、0.075、0.150 μmol剂量均有显著作用；对侧爪未观察到剂量相关效应。

机械异常痛模型中镇痛效果随剂量递增：0.150 μmol富氢水效果显著优于更低剂量，0.075 μmol优于0.018、0.036 μmol，0.036 μmol优于0.018 μmol。热痛觉过敏趋势与之类似。富氢水最大镇痛效应出现在0.150 μmol剂量，机械异常痛可达约84%最大效应，热痛觉过敏约70%最大效应。

口服布洛芬（5‑40 mg/kg）同样呈剂量依赖性减轻CFA诱导的机械异常痛与热痛觉过敏（图3，见原文PDF）。重复测量双因素方差分析：布洛芬剂量、爪子均存在显著主效应；机械异常痛交互p<0.0411，热痛觉过敏交互p<0.0471。Sidak多重比较：各剂量布洛芬均可提升同侧爪最大可能效应百分比，对侧爪无剂量相关改变。

40 mg/kg布洛芬效果显著优于5、10、20 mg/kg；10、20 mg/kg优于5 mg/kg；10与20 mg/kg之间无统计学差异。布洛芬40 mg/kg达到最大镇痛效果，机械异常痛最大效应约81%，热痛觉过敏约82%。

2.3 富氢水联合布洛芬对CFA诱导机械异常痛、热痛觉过敏的作用

选取低有效剂量富氢水（0.036 μmol，腹腔注射）、次最大中等剂量布洛芬（20 mg/kg，口服）开展单药、联合给药对比实验（图4，见原文PDF）。

富氢水单药、布洛芬单药均较生理盐水对照组显著减轻机械性异常痛；二者联合给药的抗异常痛效果显著优于任意单药（单因素方差分析 p<0.0001），最大效应百分比约80%；富氢水与布洛芬单药组之间无统计学差异。

热痛觉过敏结果趋势相似：布洛芬单药可显著缓解热痛敏；富氢水单药仅有微弱效果，和生理盐水组无统计学差异；但联合给药的抗痛敏作用显著强于单药，最大效应百分比约78%（p<0.0001）；布洛芬单药效果显著优于富氢水单药。

综上：在CFA诱导慢性炎性疼痛模型中，富氢水联合布洛芬给药，抗机械异常痛、抗热痛觉过敏效果显著优于两种药物单独使用。

2.4 富氢水、布洛芬单用及联用对CFA小鼠爪组织氧化应激与炎症的影响

采用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测爪组织4‑HNE、HO‑1、SOD‑1、NLRP3蛋白表达，评估药物对外周炎症、氧化应激的影响（图5，见原文PDF）。

CFA处理后4‑HNE表达较空白对照组（SS‑SS‑SS）显著升高（p<0.0001）。富氢水、布洛芬单药仅可部分下调4‑HNE；联合给药的下调作用更强，蛋白水平回落至接近空白对照组。

CFA炎症使HO‑1、SOD‑1蛋白表达显著上调（p<0.0001）；富氢水、布洛芬单药以及联合给药均可以维持二者高表达；联合给药组HO‑1表达显著高于生理盐水组与布洛芬单药组。

CFA处理显著升高NLRP3蛋白表达；富氢水或布洛芬单药均可下调NLRP3，但仍高于空白对照组；联合给药下调效果最强，NLRP3水平恢复接近空白对照。

结果说明：联合给药能够更强抑制4‑HNE、NLRP3，同时保留CFA诱导升高的HO‑1、SOD‑1蛋白表达。

2.5 富氢水、布洛芬单用及联用对小鼠脊髓NOX亚型蛋白表达的影响

检测脊髓NOX1、NOX2、NOX4蛋白水平（图6，见原文PDF）。CFA炎症显著上调NOX1（p<0.0010）与NOX4（p<0.0034）；各组NOX2蛋白表达没有明显改变。富氢水或布洛芬单独给药仅能轻微下调NOX1、NOX4，无统计学意义；联合给药显著逆转CFA诱导的NOX1、NOX4升高，恢复至空白对照组水平。

3 讨论

本研究证实：富氢水联合布洛芬镇痛效果优于任一药物单独使用；伴随氧化应激、炎症信号抑制，同时HO‑1、SOD‑1抗氧化蛋白维持高表达，提示富氢水有潜力作为辅助手段提升布洛芬对慢性炎性疼痛的镇痛效果。

与既往炎性疼痛动物实验一致，布洛芬呈剂量依赖性缓解CFA诱导的机械异常痛与热痛觉过敏。富氢水同样表现出剂量依赖性镇痛，拓展了本课题组既往在神经病理性疼痛模型上的发现，证实富氢水对炎性疼痛同样有效。两种药物对CFA小鼠对侧爪几乎没有作用，提示镇痛效应优先发生在炎症局部。

本研究核心发现：富氢水联用布洛芬，镇痛效果显著强于单药。既往研究报道富氢水可以和HO‑1诱导剂、大麻素类、加巴喷丁类、度洛西汀联用增强神经病理性疼痛镇痛效果；但本研究是首次证实富氢水与非甾体抗炎药联用可以增强慢性炎性疼痛的镇痛作用。需要注意，本研究没有开展正式药效相互作用分析，也没有测定布洛芬药代动力学，因此该增强效应仅能说明应答提升，不能直接判定为相加或者协同药理作用。

联合治疗是疼痛管理成熟策略：靶向互补通路，提升镇痛，同时有机会降低单药剂量，减少剂量相关不良反应风险，这对于需要长期用药的慢性疼痛尤为重要。传统炎性疼痛多模式方案包括非甾体抗炎药联合阿片类；也有对乙酰氨基酚、度洛西汀等非阿片类联合方案的研究。近年来，一些传统不作为镇痛药的药物也受到关注，例如甲氨蝶呤、二甲双胍用于骨关节炎疼痛，但尚不属于成熟的非甾体抗炎药联合疗法，其疗效、耐受性、药物相互作用、长期安全性仍有待评估。

在此背景下，富氢水凭借抗氧化抗炎、副作用极少的优势，可以通过调控氧化‑炎症通路补充布洛芬的药理作用。联合给药组4‑HNE（脂质过氧化标志物）下降最为显著，恢复至接近非炎症对照组；同时没有抑制HO‑1、SOD‑1的上调。本研究仅检测蛋白表达水平，并未直接测定酶活性与总抗氧化能力，因此只能说明内源性抗氧化蛋白表达得到保留，不等于抗氧化酶活性升高。

Nrf2通路激活相关药物（如富马酸二甲酯），可在动物炎性疼痛模型减轻氧化损伤、同时提升Nrf2/HO‑1信号，HO‑1药理激活也可通过抗氧化通路、调控NLRP3炎症小体缓解炎性疼痛。本研究联合给药组"病理脂质过氧化减轻，但内源性抗氧化防御保留"，这种有利氧化还原环境，很可能是镇痛增强的重要原因。

脊髓NOX亚型差异调控是本研究另一重要发现：CFA炎性疼痛上调NOX1、NOX4，NOX2不变；只有联合给药可以显著逆转NOX1、NOX4升高。NOX1参与炎性疼痛已有充分证据；NOX4既往更多和神经病理性疼痛相关，本研究进一步提示脊髓NOX4同样参与慢性炎性疼痛，和已有文献报道一致：CFA模型中NOX4升高，激活JAK2/STAT3‑NLRP3通路。NOX酶是活性氧重要来源，联合给药下调NOX1、NOX4，可减轻氧化应激，抑制下游炎症信号，共同促成镇痛提升。

NOX来源的活性氧是NLRP3炎症小体重要激活信号；本实验观察到联合给药同时下调NOX1、NOX4与NLRP3，提示NOX介导的氧化信号减弱与炎症小体表达下降存在关联，进而提升镇痛效果；但本实验尚不能证明NOX4在该效应中的因果功能。

课题组既往研究显示重复给予富氢水，可通过激活Nrf2‑HO‑1通路、降低氧化应激、调控神经炎症缓解慢性疼痛；本研究进一步证明单次富氢水联合布洛芬可更大程度下调NLRP3，同时下调脊髓NOX1、NOX4，提示NOX介导氧化信号减弱和炎症小体通路抑制之间存在交互；但确切分子机制仍有待完整阐明。

本研究局限性：

• 仅采用雄性小鼠、仅使用CFA单一慢性炎性疼痛模型，结果外推受限；

• 仅观察蛋白表达改变，未采用选择性药物抑制剂或基因编辑动物，不能完全确定NOX各亚型、NLRP3的因果作用；没有直接检测HO‑1、SOD‑1酶活性；

• 没有检测布洛芬药代动力学（血浆、组织药物浓度），不能排除富氢水影响布洛芬吸收、分布、代谢、组织暴露的可能性；

• 仅测试一组剂量组合；需要更多剂量组合、给药方案，以及正式药理相互作用分析，确定最优治疗方案。

讨论小结：本动物模型证实富氢水可以增强布洛芬的镇痛效果。联合给药较单药更强缓解机械异常痛、热痛觉过敏；伴随炎症爪组织4‑HNE、NLRP3下降，脊髓NOX1、NOX4下调，同时保留内源性抗氧化蛋白HO‑1、SOD‑1高表达。富氢水可以调控慢性疼痛相关氧化‑炎症通路，与布洛芬药理作用形成互补；提示富氢水具备作为非甾体抗炎药辅助用药的潜力，有望实现药物减量。本研究为富氢水用于慢性炎性疼痛辅助治疗提供临床前依据，后续需要开展口服富氢水方案研究，评估转化应用价值。

4 材料与方法

4.1 实验动物

6‑8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自西班牙巴塞罗那Envigo实验室；饲养环境：12小时光暗循环，22 ℃，相对湿度66%，自由进食饮水；入组前适应7天。动物操作遵循欧盟2010/63/EU动物实验指令、西班牙RD 53/2013法规，巴塞罗那自治大学动物伦理委员会批准（伦理编号4581，批准日期2023‑03‑31）。每笼4只，提供纸板庇护、纤维素垫料丰富环境。实验开始前动物适应测试房间1小时；每日测试顺序随机化；一名研究者给药，另一名对分组盲态的研究者完成痛行为检测，数据分析同样由盲态研究者执行。实验遵循动物实验3R原则（替代、减少、优化）。采用Excel随机函数完成随机分组，每组n=6；实验共使用126只小鼠。每日观察动物一般状态、姿势、活动、理毛、身体情况、疼痛应激表现，设定人道终点标准；本研究无动物达到人道终点。

4.2 诱导炎性疼痛

异氟烷短暂麻醉下，小鼠右后爪（同侧）足底皮下注射30 μL弗氏完全佐剂CFA；左后爪（对侧）作为自身对照。

4.3 伤害感受行为评估

机械性异常痛（von‑Frey细丝）：小鼠置于高架金属网格上的有机玻璃圆筒，适应30分钟；细丝垂直作用足底，至细丝轻微弯曲；从0.4 g开始，按照Chaplan上下法增减细丝力度；最大截断力3.0 g，记录缩爪、甩爪、舔爪作为阳性反应。

热痛觉过敏（足底热刺激仪）：小鼠置于玻璃板上方圆筒，适应30分钟；辐射热照射足底，记录缩爪潜伏期；截断时间12 s避免烫伤；每只爪子重复测量3次，间隔5分钟，取平均值。同时检测同侧、对侧后爪。

4.4 药物处理

富氢水：电解发生器制备，储备液0.3 mmol/L超纯水；每只动物临用现配，气密注射器零顶空收集，减少氢气逃逸；25 ℃条件下克拉克微电极检测氢浓度。腹腔注射剂量0.018、0.036、0.075、0.150 μmol（对应体积60、120、250、500 μL）。

布洛芬购自Sigma‑Aldrich，生理盐水稀释，口服给药，剂量5、10、20、40 mg/kg，给药体积10 mL/kg。基于量效实验，联合给药实验选用富氢水0.036 μmol腹腔注射，布洛芬20 mg/kg口服。所有药物临用前配制，对照组给予对应体积溶媒。行为学检测前1小时给药。样本量由G*Power3.1基于预实验计算；α=0.05，β=0.2（80%统计效力），每组6只动物即可检出统计学差异。行为检测结束后收集爪、脊髓组织用于Western blot。

4.5 实验流程

第‑7~‑1天：动物适应；第0天：右后爪足底注射CFA；第14天：给药前行为基线检测；第15天：给药，给药后开展行为学测试；行为结束后颈椎脱臼安乐死，采集后爪足底组织、L3‑L6段脊髓，‑80 ℃冻存用于蛋白检测（图7，见原文PDF）。

4.6 蛋白提取与蛋白质免疫印迹（Western blot）

组织剪碎，加入冰RIPA裂解液（含蛋白酶、磷酸酶抑制剂）；超声10 s；4 ℃裂解1 h；700 × g离心20 min，取上清；Bradford法测定总蛋白浓度。取60 μg总蛋白，上样缓冲液混合，95 ℃变性5 min；SDS‑PAGE凝胶电泳，转印至PVDF膜；5%脱脂奶或5%BSA室温封闭75 min。一抗4 ℃孵育过夜：抗4‑HNE、HO‑1、SOD‑1、NLRP3、NOX1、NOX2、NOX4；GAPDH作为内参。HRP标记二抗室温孵育1 h；ECL化学发光显影，ImageJ灰度定量。

4.7 统计学分析

数据表示为平均值±标准误（mean±SEM），GraphPad Prism8与SPSS28软件统计；Bartlett方差齐性检验、Shapiro‑Wilk正态检验。配对t检验用于同侧‑对侧爪子比较；量效实验采用双因素重复测量方差分析；联合给药组采用单因素方差分析，之后Sidak事后多重比较。

最大可能效应百分比计算公式：%MPE =（给药后数值‑给药前数值）÷（截断值‑给药前数值）×100。机械异常痛截断3 g；热痛觉过敏截断12 s。p＜0.05认为差异具有统计学意义。

5 结论

本研究证明，富氢水可增强CFA小鼠慢性炎性疼痛模型中布洛芬的镇痛作用。联合给药较单药更强缓解机械异常痛、热痛觉过敏；伴随爪组织4‑HNE、NLRP3降低，脊髓NOX1、NOX4下调，同时内源性抗氧化蛋白表达维持升高。本结果支持富氢水可作为非甾体抗炎药辅助用药，为慢性炎性疼痛开展进一步转化研究提供临床前证据。

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