氢气预防人工皮肤UVA老化的转录组学评估
目 的
间歇性吸入氢气可通过减轻氧化应激，从而预防长波紫外线（UVA）诱导的皮肤光老化，但其分子机制尚不明确。此外，对于并非以发病机制为主要研究方向的课题，推荐采用动物实验替代方案。本研究旨在利用人工皮肤短期体外体系，评估氢气对UVA诱导光老化的预防作用。
方 法
将人工皮肤分别以0、7、10.5 J/cm²/天的剂量进行UVA照射，随后置于含或不含1.3%氢气的CO₂培养箱中培养1天。该循环重复3次，再继续培养1天，随后开展转录组学与组织学分析。
结 果
7 J/cm²/天的UVA仅引起表皮形态轻微改变，但可显著诱导光老化相关转录组变化；而10.5 J/cm²/天的UVA则导致表皮发育不全、细胞过度凋亡，且转录组变化有限。对比7 J/cm²/天照射下加氢气与不加氢气组发现，氢气可调控UVA诱导的生物学过程与信号通路，包括NRF2介导通路、NFκB1–RelA介导通路，并抑制p53介导的细胞衰老通路。
结 论
本研究证实，在较低剂量UVA（7 J/cm²/天，总剂量21 J/cm²）照射下，人工皮肤仅出现轻微组织学改变，但可检测到光老化相关转录组变化。此外，氢气可通过皮肤表面渗透，对UVA诱导的细胞应激与衰老发挥保护作用，提示其在预防光老化方面具有潜在价值。本研究为未来氢气防治UVA诱导光老化的转化研究提供了初步实验依据。
1 引言
分子氢因可通过减轻氧化应激，对缺血再灌注损伤等疾病发挥有益作用而备受关注，长期摄入也可能促进健康。氢气可选择性清除羟自由基（•OH）等高活性活性氧（ROS），并调控核因子E2相关因子2（NRF2）、核因子κB（NF-κB）等氧化应激相关基因。
日光中含量丰富的长波紫外线（UVA，320～400 nm）可穿透表皮与真皮层，通过诱导活性氧生成，引发深皱纹、皮肤松弛、粗糙、色素沉着等光老化表现。在皮肤组织中，单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子（O₂⁻）是UVA诱导的主要活性氧；其中¹O₂在光老化中起主导作用，由O₂⁻衍生的过氧化氢（H₂O₂）与•OH也参与其中。因此，减少UVA诱导的活性氧、调控光老化相关转录组应答，有助于预防光老化。
本团队前期研究已证实，间歇性吸入1.3%氢气可抑制小鼠模型中UVA诱导的光老化表型。另一方面，三维人工皮肤等体外皮肤替代物，已逐渐成为皮肤病学研究中替代动物实验的重要工具。然而，该模型能否检测光老化早期进展，以及氢气对这些早期改变的作用，仍不明确。
本研究采用成熟的体外皮肤替代体系，结合转录组学与组织学分析，评估UVA诱导的光老化及氢气的预防作用。
2 材料与方法
2.1 人工皮肤培养及UVA照射联合氢气处理
使用可通入1.3%氢气的CO₂培养箱，气流由STEC PAC-P2系统调控。将人工皮肤置于无酚红培养基中，在37℃、5% CO₂条件下常规培养1天。
将人工皮肤随机分为6组：无UVA照射（U0）、7 J/cm² UVA照射（U7）、10.5 J/cm² UVA照射（U10.5），各组再分为不加氢气（−）与加1.3%氢气（+）亚组。更换培养基后，在超净工作台中以UVA光源按设定剂量照射，随后放回培养箱培养1天，该过程重复3次。最后再培养1天，用于后续转录组学与组织学检测。
图1 实验分组与时间线
实验分组依据UVA剂量（0、7、10.5 J/cm²）及是否暴露于1.3%氢气划分。样本接受3轮UVA照射，每轮照射后培养1天（5% CO₂，含或不含1.3%氢气）。在转录组学与组织学分析前再额外培养1天。主图中组织学分析使用U0_H2（−）、U7_H2（−）、U7_H2（+）组，RNA测序分析则包含所有组别。
2.2 组织学分析
末次UVA照射后，将人工皮肤继续培养2天，用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、4 μm切片，行苏木精-伊红（HE）染色；采用TUNEL试剂盒检测凋亡细胞。免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）、磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）、p53。抗体详细信息见补充资料。
冰冻标本经O.C.T.包埋、6 μm切片，采用二氢乙锭（DHE）荧光染料检测O₂⁻，用胶原蛋白杂交肽标记胶原降解。使用虚拟切片系统、共聚焦显微镜、荧光显微镜采集图像，并用ImageJ软件分析。
2.3 RNA测序（RNA‑Seq）分析
末次UVA照射2天后，将人工皮肤迅速液氮冷冻并于−80℃保存。使用NucleoSpin RNA Plus试剂盒提取总RNA，经质控筛选RIN≥7.0的样本建库。采用Oxford Nanopore平台进行纳米孔测序，使用MinION测序仪完成测序。
使用Guppy进行碱基识别，Minimap2将序列比对至GRCh38.p14参考基因组。采用iDEP1.1云平台分析差异表达基因（DEGs），设定FDR＜0.1、倍数变化≥2为筛选标准。基于差异基因进行KEGG富集分析与IPA通路分析。
2.4 实时荧光定量PCR
以总RNA为模板，采用一步法TB Green试剂盒进行qPCR，以GAPDH为内参，采用2^(-ΔΔCt)法计算相对表达量。引物信息见补充资料。
2.5 统计学分析
组织学与qPCR数据以平均值±标准误表示，采用单因素方差分析（ANOVA）及Holm‑Sidak事后检验，p＜0.05为差异具有统计学意义。RNA‑seq采用DESeq2进行差异分析，使用Benjamini–Hochberg法校正p值，FDR＜0.1定义为差异表达基因。
3 结 果
3.1 UVA照射与氢气对表皮形态的影响
预实验显示，10.5 J/cm²/天 UVA可诱导过度凋亡与表皮萎缩，因此重点观察7 J/cm²/天 UVA及氢气的作用。
U7组表皮上层可见核固缩，U0组与U7组表皮厚度无显著差异，氢气处理未显著改变表皮厚度。各组凋亡细胞比例与PCNA阳性细胞比例无统计学差异，但U7组呈上升趋势。
图2 氢气暴露对表皮变薄的影响
（a）HE染色人工皮肤光镜图；（b）表皮厚度定量分析；（c）TUNEL染色凋亡细胞；（d）凋亡细胞比例定量；（e）PCNA阳性增殖细胞免疫染色；（f）PCNA阳性细胞比例定量。
3.2 UVA照射与氢气对差异表达基因及生物学功能的影响
RNA测序聚类分析明确鉴定出与皮肤功能相关的基因簇（簇5）。相同UVA剂量下对比显示：U7+H₂组与U7组间的差异基因数量最多。
与U0组相比，U7组中细胞应激损伤、炎症、肿瘤相关通路显著上调；而氢气处理后，这些UVA诱导上调的通路显著下调。
图3 全局基因表达及皮肤功能相关通路分析
（a）全局基因表达热图；（b）簇5前10位富集通路；（c）各组差异基因数量；（d、e）经典通路气泡图；（f、g）IPA分析NRF2介导氧化应激通路。
PCA图显示样本聚类，火山图展示效应量与统计学显著性。
3.3 氢气对UVA照射人工皮肤NRF2介导氧化应激通路转录组的预测作用
聚焦氧化应激关键通路NRF2：与U0组相比，U7组NRF2信号及下游多数抗氧化相关基因显著上调；而加入氢气后，NRF2信号及下游抗氧化基因（SQSTM1、HMOX1、PRDX1、FTH1、GPX2、SOD、TXN、GSR、TXNRD1等）均下调。
3.4 细胞应激标志物O₂⁻、γH2AX与p53的检测
DHE标记的O₂⁻主要分布于表皮，各组表皮O₂⁻水平无显著差异。
γH2AX为氧化应激与细胞衰老相关DNA损伤标志物：与U0组相比，U7组γH2AX阳性细胞比例显著升高，但氢气处理组与未处理组无显著差异。
p53核定位结果显示：与U0组相比，U7组表皮p53阳性细胞核比例显著升高；氢气处理后该比例显著降低。
图4 氢气对ROS介导DNA损伤及p53核定位的影响
（a）DHE标记O₂⁻；（b）荧光强度定量；（c）γH2AX免疫染色；（d）阳性细胞比例；（e）p53免疫染色；（f）阳性细胞比例。
4 讨 论
本研究证实，间歇性1.3%氢气处理可显著改变UVA照射人工皮肤中光老化相关基因簇的转录组。
组织学上，7 J/cm²/天 UVA可同时促进凋亡与增殖，有助于维持表皮结构，氢气在此条件下无明显形态学影响；而10.5 J/cm²/天 UVA则导致表皮变薄、过度凋亡，提示UVA对表皮形态的影响呈剂量依赖性。人工皮肤模型与动物模型对UVA及氢气的应答差异，可能与生物环境、氢气递送途径有关：动物体内氢气可经表皮渗透与全身循环作用，而人工皮肤仅能通过表皮渗透，且缺乏血管、神经与免疫细胞，无法完全模拟在体皮肤。
转录组分析显示，7 J/cm²/天 UVA诱导的差异基因最多，氢气可逆转UVA上调的细胞应激、炎症、肿瘤相关通路，同时激活DNA修复、氧化应激抑制相关通路；而高剂量10.5 J/cm²/天 UVA仅引起有限转录组改变。提示较低剂量UVA可在不造成明显组织损伤的前提下，诱导显著的光老化相关转录组应答。
尽管上游分析中NRF2活性预测无显著差异，但氢气可下调多数NRF2下游基因，同时抑制经典NFκB1‑RelA通路，提示氢气可通过调控NF‑κB通路发挥抗光老化作用。
本研究中O₂⁻与γH2AX无组间差异，可能与样本采集时间点有关；而氢气可显著降低p53核转位，提示氢气可能通过调控p53介导的衰老通路，预防UVA诱导的光老化。
5 结 论
本研究采用人工皮肤模型证实：在较低剂量UVA（7 J/cm²/天，总剂量21 J/cm²）照射下，皮肤仅出现轻微组织学改变，但可检测到明显的光老化相关转录组变化。氢气可通过皮肤表面渗透，改善UVA诱导的细胞应激与衰老相关生物学过程，提示其在预防光老化方面具有潜在应用价值。本研究为未来氢气防治UVA诱导光老化的转化研究提供了初步实验基础。
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