氢气吸入清除活性氧的新方法
重点：本研究观察吸入氢气375毫升/分钟连续1小时对人体氧化应激指标的影响。虽然人们对氢气抗氧化效应进行了大量研究，但是氢气使用剂量仍然存在争议。重点就是吸入多少才能有效的问题。本研究采用的氢气摄取剂量比较适量，比日本过去的许多研究要多，但仍然是比较温和的剂量。每分钟300-400毫升低于目前国内常用的设备供气量，吸入时间1小时也低于国内许多设备的建议剂量。当然，由于氢气生物安全性高，增加摄取量延长时间更有利于发挥效应。但效应必需建立于严格的试验证据基础上，不能简单推断。否则的话，多少才是最好，谁才能决定？
1. 摘要
据说，生活方式相关疾病以及由衰老引起的容貌衰退都与活性氧有关。特别是，衰老已被纳入《国际疾病分类第11版》（ICD-11），被定位为一种疾病。鉴于此，衰老可被认为是具有可逆性的。衰老的成因之一是“活性氧”。活性氧大致可分为超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧，并非所有活性氧都对人体有害，其中一些还参与人体的防御机制，因此它们既有优点也有缺点。然而，若体内活性氧产生过量，就会转化为氧化作用最强的羟基自由基，而这种羟基自由基被认为是生活方式相关疾病的诱因，也是影响容貌的“敌人”。目前，羟基自由基已被列为衰老的成因之一，因此清除活性氧十分必要。为此，我们的研究团队研发了一种新型氢气发生器HyPeelinto（氢气吸入 ），并对其清除活性氧的能力进行了检测。结果观察到活性氧有所减少，本研究就此展开报告。
2. 引言
众所周知，癌症、痴呆症、心肌梗死、中风等多种生活方式相关疾病都与衰老有关。2022年，世界卫生组织（WHO）的疾病分类系统《国际疾病分类第11版》（ICD-11）中新增了“与衰老相关”的编码。由此，尽管衰老本身不可逆，但衰老过程具有可逆性，且被视为促进健康长寿、预防其他疾病的医疗干预和治疗目标。因此，人们越来越需要借助生物标志物来定量衡量与疾病风险相关的衰老程度，相关生物标志物的识别和检测方法也在不断发展。活性氧就是其中一种备受关注的生物标志物。在这些因素中，生活方式相关疾病有可能引发致命疾病。生活方式相关疾病是对因日常生活习惯而引发的疾病的统称，并非特定的疾病名称[1]。它主要与不良饮食、缺乏运动、吸烟、酗酒、睡眠不足和压力有关[2-7]，已知这些因素会在多年间导致体内慢性炎症，进而引发生活方式相关疾病[8]。典型的生活方式相关疾病包括糖尿病、高血压、血脂异常、动脉硬化、心脏病、脑血管疾病和恶性肿瘤[9]。生活方式相关疾病在早期往往没有症状，且会随着年龄增长而加重，这可被视为衰老的一部分[10]。此外，生活方式相关疾病可能会导致死亡，因此治疗难度较大[11]。因此，“预防”生活方式相关疾病被认为至关重要。由于生活方式相关疾病由上述原因引发，因此审视这些因素并调整日常习惯十分重要，例如均衡饮食、适度运动、戒烟、适度饮酒、充足睡眠和压力管理。定期进行健康检查以便及早发现并应对疾病也很重要。生活方式相关疾病是可以通过自身的认知和行动来预防和改善的疾病[12]。人们认为，努力践行健康的生活方式，就有可能预防未来患上生活方式相关疾病。活性氧（ROS）是生活方式相关疾病的成因之一[13]。在正常生理功能中，活性氧（ROS）在细胞信号传导中发挥着重要作用[15]，但另一方面，它们会在体内引发氧化应激，导致细胞和组织损伤[16-17]。当人体摄入葡萄糖后，葡萄糖会通过糖酵解进入三羧酸循环（TCA循环），然后进入电子传递链以生成三磷酸腺苷（ATP）[18]。当葡萄糖不足时，人体会通过燃烧脂肪和蛋白质来生成ATP。换言之，ATP对维持人类生命至关重要[19]。生成ATP需要大量氧气，这些氧气自然是通过呼吸摄入的。其中大部分氧气参与能量生成，但有百分之几的氧气会转化为活性氧（ROS）[20]。活性氧对人体既有好处也有坏处。好处是，活性氧在人体防御机制中发挥作用，能通过中性粒细胞中的颗粒杀灭细菌和癌细胞[21]。已知活性氧与包括恶性肿瘤在内的多种生活方式相关疾病以及衰老有关[22]。目前，已知的活性氧有以下四种：1. 超氧阴离子（O2-）、2. 过氧化氢（H2O2）、3. 羟基自由基（·OH）、4. 单线态氧（1O2）[23]。近年来，国内外都在研究清除活性氧的方法，旨在预防疾病和抗衰老[24]。自ICD-11将衰老列为疾病名称以来[25]，预计未来对抗氧化剂的研究将会进一步深入。人们认为，这项研究不仅有助于美容，还将为预防生活方式相关疾病做出贡献。因此，我们的研究小组聚焦于被认为危害性特别大的羟基自由基[26]，研发了可生成氢气的HyPeelinto（氢气吸入 ），并对其清除活性氧的能力进行了检测。氢气吸入 是由NBS有限公司研发的一款先进专业美容设备，集氢剥离和导入护理功能于一体。该设备融入了护肤技术，目前已在日本的诊所和美容院投入使用。这一款设备可进行多种护理，但本次研究重点关注氢气吸入（内在护理），即通过鼻腔吸入高浓度氢气，使其在肺泡中扩散，旨在清除引发生活方式相关疾病的活性氧，同时对内在美容也有一定功效。因此，本次我们使用氢气吸入 进行氢气吸入实验，并对其清除活性氧的能力进行了检测。
3. 材料与方法
本研究已获得国际老年学和老年病学学会伦理委员会的伦理批准（伦理审查编号：ISGN_NI10122024、ISGN_NI10052024）。此外，研究使用了图1所示的设备，通过鼻导管经鼻腔吸入氢气。另外，在预试验中，每次呼吸吸入的氢气平均量为25毫升，按照平均每分钟15次的呼吸频率计算，每分钟吸入的氢气量约为375毫升。这大约是所产生活性氧数量的8倍，因此被认为适合用于清除活性氧。
3.1. 研究类型
开放标签功能评估
3.2. 减少偏倚的措施
为保证氢气吸入条件的一致性，受试者在氢气吸入前后均避免食用及摄入其他被认为可能在体内产生活性氧的食物。
3.3. 研究方法
3.3.1. 氢气吸入：8名提供充分知情同意的受试者，按照图2所示方式吸入由Hy Peel into释放的氢气，持续1小时，并在吸入氢气前后分别进行尿液和血液检测。
图2：通过鼻导管吸入氢气
3.3.2. 8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）检测：以清晨收集的尿液作为对照组，吸入氢气1小时后立即收集尿液作为检测组。收集的尿液经冷冻保存后，委托日本静冈县的日本抗衰研究所（JaICA，日研セイル株式会社）进行检测，先校正肌酐水平，再测定8-OHdG含量。
3.3.3. 活性氧代谢物（d-ROMs）和生物抗氧化潜能（BAP）检测：初始样本量为8例，但检测过程中发现严重疏漏，最终基于数据可靠性将样本量确定为5例。本实验在吸入氢气前后分别采集血液，从中提取血清并冷冻保存，随后委托东京的WISMERLL株式会社 redox研究中心进行检测，测定d-ROMs和BAP水平。此外，使用IBM SPSS Statistics（29.0版本）进行各项统计分析，显著性水平设为5%。
3.3.4. 受试者条件：
纳入标准：
- 签署知情同意时年龄在20-60岁之间（该年龄段人群需关注生活习惯）；
- 充分理解研究方案并能自主同意参与。
排除标准：
- 患有明显基础疾病者；
- 吸烟者；
- 对研究材料有过敏史者；
- 临床研究负责人判定其行为可能影响体内活性氧升高者；
- 无法维持日常饮食习惯者；
- 目前参与其他临床试验，或自签署同意书之日起过去3个月内参与过其他临床试验者；
- 研究期间计划参与其他试验者；
- 临床研究医师判定为不适合参与的其他情况。
终止标准：
- 对研究材料出现过敏反应；
- 受试者撤回同意；
- 临床研究负责人基于健康风险或伦理原因判定适合终止参与的其他情况。
3.3.5. 受试者数量：确定依据为满足验证性研究实施需求的样本量。但在d-ROMs和BAP检测中，因部分受试者存在疏漏，样本量最初设定为6例（以满足统计分析要求）。
4. 结果
4.1. 8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）
8-OHdG是DNA受氧化应激损伤时产生的物质[27]，是体内产生活性氧（ROS）导致DNA氧化损伤的代表性指标，常用作氧化应激的生物标志物[28]。由于8-OHdG通常会释放到尿液中，因此可通过无创方式测定其浓度，用于评估体内氧化应激程度[29,30]。结果如下（表1、图3）：数据符合正态分布，经配对t检验分析，P>0.05，无显著差异（P=0.158）。
表1：尿液中8-OHdG的变化情况
4.2. 活性氧代谢物衍生物（d-ROMs）
活性氧代谢物衍生物（d-ROMs）检测是通过测量血液中存在的活性氧代谢物衍生物（主要为脂质氢过氧化物）来评估体内氧化应激水平的一种检测方法[31-32]。具体而言，该方法聚焦于活性氧与脂质、蛋白质、DNA等生物成分反应时在体内产生的氧化产物，并对其积累量进行定量测量[33]。结果如下（表2、图4）：经配对t检验分析，差异具有统计学意义（P<0.05，P=0.015）。从图中可以看出，体内氧化应激水平有所降低。
图3：尿液中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的变化情况
4.3. 生物抗氧化潜能（BAP）
生物抗氧化潜能（BAP）是一种用于测量血液中抗氧化物质抗氧化能力的检测方法，能够定量评估机体抵御体内产生活性氧所造成的氧化损伤的能力[34]。也就是说，BAP值较高可能意味着抗氧化能力较强。结果如下（表3、图5）：经配对t检验分析，差异具有统计学意义（P<0.05，P=0.035）。数据显示抗氧化能力有所下降，这是因为吸入氢气清除了活性氧，使得机体对自身抗氧化能力的需求降低，从而导致抗氧化能力出现暂时性下降。
5.讨论
本研究结果表明，活性氧（ROS）总体上能够被清除。活性氧（ROS）是基于氧分子生成的一类高反应性含氧分子的统称[35]。它们在化学性质上比普通氧分子更不稳定，具有促进体内氧化反应的特性[36]。在机体正常代谢过程中，线粒体也会产生活性氧[37]，但已知生活方式中的外部因素（如吸烟和化学物质接触）也会导致其产生[38]。如上所述，活性氧大致可分为以下四类： 1） 超氧阴离子（O₂⁻・） 产生于线粒体电子传递系统和黄嘌呤氧化酶系统。虽然其反应性相对较低，但它是其他活性氧的前体[39]。它还存在于中性粒细胞等的颗粒中，在生物防御中发挥作用[40]。 2） 过氧化氢（H₂O₂） 由超氧化物歧化酶（SOD）催化超氧阴离子（O₂⁻・）歧化反应生成。它能穿过细胞膜，并通过芬顿反应生成羟基自由基[41]。 3) 羟基自由基（・OH） 反应性极强，已知会对生物体组织造成损伤[42]。体内存在的超氧化物歧化酶（SOD）等酶可以清除超氧阴离子，过氧化氢酶等酶可以清除过氧化氢，但体内没有能够清除羟基自由基的酶，因此其对生物体的影响极大[43]。 4） 单线态氧（¹O₂） 是氧分子的激发态，由紫外线照射产生，具有极强的氧化能力[44]。已知单线态氧会导致皮肤色斑和皱纹[45]，因此需要采取预防措施。 虽然活性氧是机体内代谢和防御反应所必需的分子，但活性氧的过度积累会引发氧化应激，而氧化应激是多种慢性疾病和衰老的诱因[46]。因此，活性氧既有优点也有缺点，由于强效抗氧化剂可能会对生物防御产生负面影响，因此适度的抗氧化是必要的。其中，被认为毒性最强的羟基自由基可通过芬顿反应[47]：
Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + •OH + OH⁻
以及哈伯-韦斯反应[48]：
O₂•⁻ + H₂O₂ → •OH + OH⁻ + O₂
生成，因此需要通过外部因素将其清除。 本研究中使用的氢气发生了如下反应，研究者认为通过该反应可将羟基自由基转化为水分子，从而实现清除[49]： •OH + H₂→H₂O+ H• 在讨论本研究结果之前，我们关注了吸入氢气前后血液的颜色变化。
尽管这只是一种视觉观察，但很明显，吸入氢气后血液颜色更深了。这意味着吸入一小时氢气后，血液得到了更有效的利用。
5.1. 关于各种生物标志物的思考
8-羟基鸟苷（8-OHdG）是一种核苷，是鸟苷的氧化衍生物。8-羟基鸟苷浓度的测定被用作活性氧的生物学指标[28]。尿液中出现的8-OHdG值是活性氧的一个指标。该值越低，体内活性氧的量就越少。然而，本次研究虽然未发现显著差异，但总体呈上升趋势。原因在于，通常需要等待12至24小时才能测量8-OHdG。但在本研究中，由于是在吸入氢气后立即测量尿中的8-OHdG，可能是氢气在吸入后立即与氧化的DNA发生反应，从而产生了大量的8-OHdG。这被认为是导致8-OHdG值较高的原因。因此，考虑到见效较快的d-ROMs值有所下降，从长期来看，8-OHdG值有望下降。所以，本研究结果表明氢气可能进入血液并立即发生反应。d-ROMs用于测量氧化应激水平（由活性氧和自由基等引起的氧化损伤）[32]。该值越高，体内的活性氧就越多。本研究结果显示其有统计学意义上的下降趋势，这表明使用该设备吸入氢气可清除活性氧。因此，吸入氢气清除活性氧可能对预防生活方式相关疾病和美容护理有效。基于此，本研究被认为具有重要价值。d-ROMs反映氧化应激的结果，并非直接测量活性氧本身，因此被视为衡量活性氧减少的可靠生物标志物[50]。
目前，d-ROMs在疾病预防、早期检测和治疗效果评估等广泛的医疗和健康领域得到应用[51]。由于它是一种定量且操作简便的检测方法，预计未来在预防医学和抗衰老医学领域会有更广泛的应用。BAP表示抗氧化能力（清除活性氧和自由基的能力）[34]，可以说该值越高，抗氧化能力就越强。从本研究结果来看，BAP总体呈下降趋势，这可能是由于氢气导致生物体内抗氧化能力相对降低。也就是说，这表明氢气可能具有快速起效的作用。也有可能氢气本身发挥了类似BAP的作用。长期吸入氢气可能会提高机体原本的抗氧化能力，因此，相比临时吸入氢气，持续吸入氢气是有必要的。
5.2. 这些结果表明，使用氢气吸入 可清除活性氧
活性氧，尤其是羟基自由基，据称与所有生活方式相关疾病都有关系[52]。众所周知，它还会对容貌产生不良影响[53]。当前备受关注的生活方式相关疾病，总体而言是与衰老相关的现象，而不仅仅是年龄增长的结果。生活方式相关疾病导致的死亡约占总死亡人数的一半，上述观点表明，预防由活性氧引起的衰老是一个非常重要的因素。例如，就癌症而言，癌细胞因细胞分裂错误而增殖，当它们在器官等部位定植时，就会引发癌症，而活性氧被认为与这一过程密切相关。如上所述，活性氧大致可分为超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧，它们都被认为与衰老密切相关。特别是这些活性氧可能会增加患癌风险，因此清除活性氧的重要性不言而喻。我们以癌症为例，是因为发现本研究中使用的氢气也能清除活性氧。然而，随着人类的进化，生活方式也在发生变化，使用这种氢气清除活性氧有可能改善体内环境，不仅适合预防生活方式相关疾病，还适合美容。通过维持体内环境的恒定稳态并清除活性氧，有可能使身体恢复到原本健康的状态。从这个角度来看，本研究的意义极为重大。
6. 结论
我们发现，我们研发的设备能够清除活性氧。特别是d-ROMs的显著下降反映了活性氧的清除，这被认为是一项重要的结果。有多种物质可以清除活性氧，但它们也可能会清除那些在机体防御反应中发挥作用的活性氧（如超氧阴离子和过氧化氢），这种可能性不容忽视。特别是如前所述，氢气与羟基自由基的反应性很强，因此被认为在预防生活方式相关疾病和美容护理方面具有显著优势。本研究中，d-ROMs下降的结果是令人满意的，但在与活性氧的时效性清除相关的8-OHdG方面，结果却与预期相反。不过，通过开展本研究，这一问题得到了解释。未来，我们希望继续研究长期吸入氢气会产生怎样的结果。
7. 研究合作
在开展本研究过程中，日本爱知县的NBS有限公司提供了研究资金和试验材料，我们开展了联合研究。NBS有限公司还协助了本文的撰写。
8. 伦理考量
本研究获得了国际老年学和老年病学学会伦理委员会的伦理批准（伦理审查编号：ISGN_NI10122024、ISGN_NI10052024）。
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