氢气+基因疗法预防术后认知障碍

超声辅助氢气使氢基因疗法预防术后认知障碍

术后认知功能障碍（POCD）在手术后经常发生，会导致住院时间延长、医疗费用增加，还可能引发长期的认知损害。尽管术后认知功能障碍影响重大，但目前仍然缺乏有效的预防和治疗策略。神经炎症在术后认知功能障碍的发病机制中起着关键作用。为了解决这一问题，我们开发了一种氢气释放剂，该释放剂利用超声辅助的氢基因疗法，能够以时空可控的方式修复神经炎症微环境，从而有效预防麻醉/手术诱导的认知损害。利用聚焦超声，可以有控制地打开血脑屏障，使携带小干扰RNA（siRNA）的氢气释放剂（HPPS）能够有效地递送至神经炎症部位。一方面，氢气释放剂能够有效地产生氢气，以清除过量的羟基自由基；另一方面，它利用siRNA靶向并减少tau蛋白的磷酸化。这种靶向氢基因治疗策略已在小鼠和大鼠的术后模型中得到验证，可显著减轻神经炎症，并改善术后的空间记忆和物体识别能力。本研究引入了一种新颖且有效的策略，用于预防麻醉/手术诱导的认知损害，并为其他神经炎症性疾病的治疗提供了新的思路。

1. 引言

术后认知功能障碍（POCD）的特征是记忆力下降、注意力难以集中以及语言能力出现问题，这些症状通常在麻醉和手术操作后出现。[1] 根据手术类型的不同，术后一周内认知功能障碍的发生率在11%到51%之间。[2, 3] 这种综合征经常会导致住院时间延长、医疗费用上升、死亡率增加、恢复延迟以及长期的认知衰退[2]，成为更严重认知恶化的催化剂。[4] 尽管术后认知功能障碍影响很大，但其有效的预防措施仍然难以捉摸。来自我们实验室[5] 和其他实验室[6, 7] 越来越多的证据表明，神经炎症过程在术后认知功能障碍的发生和发展中起着关键作用。手术引起的应激会激活小胶质细胞，使其进入促炎状态，从而形成神经炎症环境。[8, 9] 研究中观察到tau蛋白的磷酸化增加，这可能进一步导致认知功能障碍。[10, 11] 术后认知功能障碍在机制和病理生理学上与阿尔茨海默病有相似之处，其中tau蛋白与神经炎症之间的相互作用已有充分记录。过度磷酸化的tau蛋白会导致轴突缺陷和神经原纤维缠结，激活小胶质细胞并持续引发炎症。[12] 这个过程形成了一个反馈循环，加剧了神经元损伤，促使tau蛋白扩散和神经炎症蔓延。[13-15] 导致术后认知功能障碍的应激因素还可能包括内源性脂多糖刺激和tau等病理性蛋白聚集体。这些因素会引发小胶质细胞失衡，释放大量免疫因子，推动疾病进展。[16] 鉴于tau蛋白和神经炎症在认知功能障碍发展中起重要作用，针对减轻神经炎症和预防tau蛋白磷酸化有望在术后认知功能障碍的预防和治疗中发挥重要作用。

氢气疗法是一种有效的抗炎策略。氢气专门靶向并中和高度有毒的自由基，如羟基自由基（·OH），有效减轻氧化应激。[17] 这种治疗方法已在心肌缺血再灌注、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病等病症中显示出显著疗效。[18] 然而，氢气在生物系统中不受控制的分布和低溶解度限制了它在特定靶点的积累能力，从而限制了其治疗潜力。实现足够高的氢气浓度并确保长时间的暴露对于有效治疗至关重要。因此，设计有针对性的、大容量递送和可控释放氢气的策略对于提高治疗效果至关重要。最近，产氢纳米平台的进展促进了病理组织中氢气浓度的局部增加，具有巨大的临床潜力。[19, 20] 值得注意的是，硅烷（SiH）作为一种高效的氢气释放剂，[21] 具有固有的二维结构和超高的表面积，提供了丰富的吸附位点。这一特性有助于同时储存氢气和负载tau-siRNA，这可能有助于减轻海马组织中的神经炎症。神经炎症是术后认知功能障碍的关键病理特征，而tau蛋白的过度磷酸化会导致与认知衰退相关的异常聚集，使其成为一个关键的治疗靶点。基于siRNA的疗法可以特异性地靶向tau蛋白，在精准医学中具有很大的前景。由于siRNA疗法能够精确沉默与疾病相关的基因，它作为一种潜在的治疗方法受到了关注。[22] 它在靶向以前 “无药可治” 的遗传途径方面具有显著优势。然而，有效的递送仍然是一个主要挑战。siRNA递送的主要挑战包括确保其在血液中的稳定性，因为siRNA容易被核酸酶降解。此外，由于其分子量大且带负电荷，阻碍了膜的通透性，因此很难实现有效的细胞摄取。将其靶向递送至特定组织或细胞仍然是另一个主要障碍，因为脱靶效应和免疫激活会降低治疗效果并增加副作用。

作为siRNA的载体，纳米材料通过改变siRNA对降解的易感性以及克服其负电荷和其他不利物理性质带来的挑战，革新了其递送系统。这种方法是siRNA递送的一种有前景的策略。二维纳米片硅烷（SiH）可以在产生氢气的同时作为siRNA的载体。对SiH的表面修饰赋予了它保护siRNA的能力，使其成为基于氢气的基因治疗中的关键组成部分。这种修饰使得双靶点治疗策略成为可能。将siRNA运输到大脑存在很大困难，主要是因为血脑屏障（BBB）的限制特性。[23] 微泡辅助聚焦超声（FUS+MBs）提供了一种低侵入性的策略，可以暂时破坏血脑屏障。[24] 这种方法可以增加局部药物浓度和疗效，同时降低药物剂量和副作用。目前该方法正处于临床前试验阶段。[25]

在本研究中，我们开发了一种氢气释放剂，利用超声促进的氢基因疗法来预防麻醉/手术诱导的认知损害。首先，使用聚焦超声打开血脑屏障，促使负载tau-siRNA的氢气释放剂（HPPS）递送至双侧海马区（图1）。氢气释放剂能够有效地产生足够的氢气，有效清除羟基自由基并减轻神经炎症。此外，HPPS在结构降解释放siRNA的同时释放氢气，从而有效地打破病理性tau蛋白循环。这种双效策略显著增强了对麻醉/手术诱导的认知损害的预防效果。我们的研究表明，在部分肝切除术诱导的术后认知功能障碍模型中，术前静脉注射HPPS可使小鼠海马区tau蛋白表达降低50%，同时小鼠的空间识别、物体位置记忆和探索行为也有显著改善。HPPS的疗效在大鼠模型中进一步得到验证，证实了我们方法的可行性。本研究开发了一种新颖有效的治疗系统，旨在预防麻醉/手术诱导的认知损害。它提出了创新的方法来应对该领域中遇到的挑战，并为治疗其他神经炎症性疾病提供了新的解决方案。

图1：超声辅助氢气释放剂的示意图，该释放剂通过氢基因疗法预防麻醉/手术诱导的认知损害。

2. 结果

2.1 用于递送tau小干扰RNA（siRNA）的氢气释放剂（HPPS）的合成与表征

在本研究中，我们开发了一种氢气释放剂，利用超声辅助的氢基因疗法来预防术后认知功能障碍（POCD）。首先，我们按照已有的方法[21]，在零下20摄氏度用浓盐酸蚀刻层状化合物硅化钙（CaSi₂）来合成多层硅烷（SiH）。根据反应式：3CaSi₂ + 6HCl → 3CaCl₂ + 6SiH，[21] 浓盐酸用于从硅化物的晶体结构中去除Ca²⁺层。这个过程去除了大部分的钙元素（图S1a、b，补充信息），形成了一种类似书本的结构（图2a、b）。经过36小时的深度超声处理，并用无水乙醇洗涤以去除杂质后，得到了少层的硅烷（SiH），呈现出典型的二维片状形态（图2c、d；图S1c，补充信息）。为了提高硅烷（SiH）在生理环境中的分散性和生物相容性，我们进一步对纳米片进行了修饰。通过以不同质量比用甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺（mPEG-d-PEI）包裹硅烷（SiH）（图S2a，补充信息），我们确定了最佳的包裹比例，该比例能提供最佳的水分散性、最高的稳定性，并允许氢气缓慢释放。这个最佳比例是通过评估与磷酸盐缓冲液（PBS）反应6小时后片状结构的保存情况来确定的，如透射电子显微镜（TEM）图像所示（图S2b，补充信息）。确定的最佳质量比为5:1。以5:1质量比修饰的mPEG-d-PEI包裹的硅烷（称为HPP）在各种溶液中表现出优异的分散性（图S2c、d，补充信息）。

图2：用于递送tau小干扰RNA（siRNA）的氢气释放剂（HPPS）的合成与表征。a）前驱体硅化钙（CaSi₂）粉末的扫描电子显微镜（SEM）图像。b）经盐酸剥离后得到的大尺寸硅烷（SiH）纳米片的SEM图像。c、d）超声处理后硅烷（SiH）纳米片的透射电子显微镜（TEM）图像。e）HPP的相应元素映射图。f）硅烷（SiH）和HPP的拉曼光谱，以及HPP与磷酸盐缓冲液（PBS）反应6小时后的相应反应产物的拉曼光谱。g）HPP的原子力显微镜（AFM）图像。h）通过琼脂糖凝胶电泳分析HPP与siRNA在不同质量比（w/w）下对tau siRNA的负载情况（n = 3个独立样本）。i）通过气相色谱法定量测定硅烷（SiH）、HPP和HPPS在磷酸盐缓冲液（PBS）中产生的氢气累积量。j）硅烷（SiH）、HPP和HPPS的Zeta电位（n = 3个独立样本）。k）硅化钙（CaSi₂）、硅烷（SiH）、HPP和HPPS的粒径（n = 3个独立样本）。l）使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）法测定HPPS清除羟基自由基的活性（n = 3个独立样本）。m）使用电子顺磁共振（EPR）光谱法评估HPPS清除羟基自由基的能力（n = 3个独立样本）。n）通过对苯二甲酸（PTA）法评估HPPS消耗羟基自由基（•OH）的活性（n = 3个独立样本）。

对HPP进行的透射电子显微镜（TEM）元素分析证实了碳（C）和氮（N）元素的存在（图2e）。使用拉曼光谱分析修饰前后硅烷（SiH）的特征振动模式，确认了修饰剂的成功负载，在1100 cm⁻¹处的峰归属于C─O─C键的伸缩振动（图2f）。拉曼光谱显示了HPP与PBS反应6小时前后的特征峰，表明反应产物中不再存在Si–H键（图2f）。原子力显微镜（AFM）成像显示，HPP主要为单层，平均厚度约为1纳米（图2g）。与晶体硅相比，硅烷（SiH）和HPP的X射线衍射（XRD）图谱显示出二维结构，这与硅化钙（CaSi₂）晶体中保留的折叠Si（111）平面有关（图S3，补充信息）。

将HPP与制备好的tau siRNA混合30分钟。采用凝胶电泳评估HPP/siRNA对siRNA的结合能力，选择10:1的质量比用于后续实验（图2h）。

硅烷（SiH）纳米片表面的氢键有助于在中性PBS中有效地释放氢气。使用气相色谱法定量测定氢气的释放量，结果表明HPP在12小时内逐渐释放氢气，而硅烷（SiH）在1小时内完全释放氢气，证实了HPP在PBS中的持续释放性能（图2i）。负载siRNA后，HPPS释放氢气的速率与HPP相似。正如预期的那样，经过mPEG-d-PEI修饰后，硅烷（SiH）的平均表面电荷从−13.07 mV变为25.89 mV，有利于通过静电力使带负电荷的siRNA附着（图2j）。当成功负载tau-siRNA时，HPP的平均电荷变为2.15 mV（图2j）。动态光散射（DLS）测量表明，HPP在各种溶液中具有良好的分散性（图S2d，补充信息），在无水乙醇中平均粒径从183.3纳米（硅烷（SiH））增加到215.3纳米（HPP）（图2k）。为了评估硅烷（SiH）和HPPS在生理条件下的稳定性和分散性，在不同时间点（1、3、6和12小时）分析了这两种材料在PBS中的粒径分布。这些结果表明，HPPS的聚乙二醇-聚乙烯亚胺（PEG-PEI）表面修饰显著增强了其胶体稳定性和分散性，使其更适合生物医学应用（图S4a、b，补充信息）。当HPP和siRNA成功负载时，HPPS的平均直径上升到232.5纳米（图2k）。此外，在中性条件下，与HPP结合的siRNA在经过4小时的核糖核酸酶A（RNase A）处理后仍未降解，这表明HPP对siRNA具有保护作用（图S5，补充信息）。

评估HPPS清除活性氧（ROS）的能力对于预测其抗氧化潜力至关重要。使用芬顿（Fenton）反应诱导羟基自由基（·OH）的产生，并利用TMB法评估HPPS清除·OH的能力，结果表明该能力具有浓度依赖性，HPPS浓度越高，清除·OH的活性越强（图2l）。HPPS的抗氧化能力还体现在它能显著降低ABTS自由基阳离子的吸光度上（图S6，补充信息）。使用电子顺磁共振（EPR）光谱法评估HPPS的清除能力。结果表明，HPPS以浓度依赖的方式清除·OH自由基，浓度越高，清除活性越强（图2m）。探针对苯二甲酸（PTA）通过与过氧化氢（H₂O₂）反应生成具有荧光的化合物2-羟基对苯二甲酸，该化合物在425纳米处有荧光峰。在HPPS存在的情况下，荧光强度显著降低，表明HPPS能有效消耗H₂O₂（图2n）。

2.2 对活性氧（ROS）诱导的细胞损伤的保护作用

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法评估HPPS在HT22和BV2细胞系中的安全性，结果显示即使在高达300 µg/mL的浓度下也没有明显的细胞毒性（图S7a，补充信息）。暴露于能诱导高水平活性氧（ROS）的芬顿试剂下，导致两种细胞系的细胞活力降至50%以下（图S7b，补充信息）。然而，随着HPPS浓度的增加，细胞活力有所提高，表明其对活性氧（ROS）诱导的损伤具有很强的保护作用（图S7b）。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）证实，在与HT22和BV2细胞共孵育6小时后（HPP = 200 µg/mL；25 nM siRNA），大部分Cy3标记的HPPS已经进入细胞（图S8a、b，补充信息）。我们进一步评估了HPPS清除细胞内活性氧（ROS）并保护细胞的能力。发现HPPS是芬顿试剂诱导的活性氧（ROS）的有效抑制剂，能减少HT22和BV2细胞中羟基自由基（·OH）造成的损伤和细胞毒性。当HPPS和芬顿试剂同时加入培养基中时，如2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色所示，活性氧（ROS）的产生显著减少（图3a、b；图S9a、c，补充信息）。钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein-AM）结合碘化丙啶（PI）染色显示，加入HPPS后，芬顿试剂诱导的细胞凋亡减少（图3a；图S9a、b，补充信息）。为了量化活性氧（ROS）的清除能力，流式细胞术显示，与对照组相比，HPPS显著降低了细胞内DCFH-DA的荧光强度，表明活性氧（ROS）水平明显下降（图3d、e；图S9d、e，补充信息）。HPPS还通过中和活性氧（ROS）减少了DNA损伤。我们研究了HPPS保护DNA免受芬顿试剂诱导的双链断裂的能力。γ-H2AX（一种DNA损伤标记物）的免疫荧光显示，用HPPS预处理的细胞中γ-H2AX焦点显著减少，表明HPPS能保护DNA免受双链断裂的影响（图3f）。过量的活性氧（ROS）会导致细胞生物分子如脂质、DNA和蛋白质的损伤。比率探针C11-BODIPY581/591（一种亲脂性荧光染料）用于检测脂质氧化，脂质过氧化会导致其颜色从红色变为绿色。如图3f所示，HPPS有效地减轻了脂质氧化应激，抑制了脂质过氧化物的形成。蛋白质羰基化是蛋白质氧化的结果，反映了氧化应激对蛋白质造成损伤的程度，这可能导致蛋白质构象改变和功能丧失。使用2,4-二硝基苯肼（DNPH）法，我们发现HPPS能保护蛋白质免受活性氧（ROS）诱导的羰基积累（图3g）。上述数据表明，HPP和HPPS纳米片具有出色的清除活性氧（ROS）的能力。

图3：HPPS清除活性氧（ROS）并保护细胞免受ROS诱导的脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质羰基化。a）用DCFH-DA和钙黄绿素-AM/碘化丙啶（PI）（L/D表示活细胞/死细胞）对HT22细胞进行染色的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，细胞经过芬顿试剂处理以及不同的处理方式（对照组（Con）、磷酸盐缓冲液（PBS）、小干扰RNA（siRNA）、HPP、HPPS）。HPP浓度为200 μg/mL，siRNA浓度为25 nM。孵育时间为12小时。展示了每组三个重复实验中的一张代表性图像（n = 3个生物学独立实验）。b）经过芬顿试剂处理以及不同处理方式（对照组（Con）、PBS、siRNA、HPP、HPPS）的HT22细胞的CLSM图像中ROS的荧光强度（n = 3个生物学独立实验）。c）经过芬顿试剂处理以及不同处理方式（对照组（Con）、PBS、siRNA、HPP、HPPS）的HT22细胞中钙黄绿素-AM/碘化丙啶（PI）的相应荧光强度（n = 3个生物学独立实验）。d）经过芬顿试剂处理以及不同处理方式（对照组（Con）、PBS、siRNA、HPP、HPPS）的细胞中ROS水平的流式细胞术（FCM）分析及相应的荧光强度（n = 3个生物学独立实验）。e）经过芬顿试剂处理以及不同处理方式（对照组（Con）、PBS、siRNA、HPP、HPPS）的HT22细胞中ROS的典型流式细胞术分析结果（n = 3个生物学独立实验）。f）CLSM免疫荧光图像，描绘了HT22细胞中γH2AX DNA损伤位点，以及用C11-BODIPY581/591染色可视化的脂质过氧化情况，细胞经过芬顿试剂处理以及不同条件（对照组、PBS、siRNA、HPP和HPPS）（n = 3个生物学独立实验）。g）经过芬顿试剂处理以及不同处理方式（对照组（Con）、PBS、siRNA、HPP、HPPS）的HT22细胞的蛋白质羰基化水平（n = 5个生物学独立实验）。数据以平均值±标准差表示。p < 0.0001，*p < 0.001，p < 0.01，*p < 0.05，ns：无显著性差异。

2.3 HPPS的细胞内抗炎作用和基因沉默效率

氢气表现出多种生物学功能，包括抗氧化、抗凋亡和抗炎活性。[26, 27] HPPS可能减轻氧化应激并抑制炎症通路的激活，从而有助于使小胶质细胞维持在非极化或M2极化状态。鉴于小胶质细胞的激活在神经炎症的发病机制中起着关键作用，我们旨在阐明HPP是否调节小胶质细胞的极化状态，特别是其对M1/M2极化的影响。为此，用1 μg/mL的脂多糖（LPS）处理BV2细胞，以诱导其向M1表型极化。使用流式细胞术量化M1标记物CD16/32和M2标记物CD206的表达。对BV-2细胞的表型分析显示，LPS刺激导致M1/M2比值升高，而HPPS处理后该比值显著降低（图4a，图S10，补充信息；p < 0.01，LPS + PBS组与LPS + HPPS组相比）。这些发现表明，HPPS有效地减弱了LPS诱导的小胶质细胞的M1极化。此外，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平的实验表明，HPP减轻了LPS诱导的促炎反应（图S11，补充信息）。

图4：HPPS的细胞内抗炎作用和基因沉默效率。a）在LPS和不同处理方式（对照组（Con）、PBS、siRNA、HPP、HPPS）下BV2细胞极化的典型流式细胞术分析（n = 3个生物学独立实验）。b）用Cy3标记的HPPS纳米系统培养6小时的HT22细胞的Z轴堆叠CLSM图像。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）对细胞核进行染色，用溶酶体绿色荧光探针（LysoTracker Green，绿色）标记内体/溶酶体，用Cy3（红色）标记HPPS。c）细胞中的相应荧光强度。d）在冈田酸（OKA）刺激下，存在PBS、siRNA、HPP、HPPS时，对tau蛋白和tau蛋白磷酸化的蛋白质免疫印迹（Western blot）分析（n = 3个生物学独立实验）。e）在OKA处理下对tau蛋白表达的免疫荧光分析。HT22细胞与PBS、siRNA（S）、HPP和HPPS共同孵育。

使用CLSM检查HPPS在细胞内的定位，结果显示Cy3标记的siRNA（红色荧光）与溶酶体（绿色荧光）部分共定位，并且有一定程度的溶酶体逃逸，这表明siRNA成功释放（图4b、c；图S12，补充信息）。tau蛋白病变与慢性神经炎症、神经退行性变和认知障碍密切相关。用HPPS（HPP = 200 μg/mL；25 nM siRNA）预处理36小时导致tau mRNA显著敲低，与对照组相比降低了70%（图S13，补充信息）。Western blot分析和免疫荧光进一步证实了tau蛋白表达的降低（图4d、e；图S14a，补充信息）。用HPPS处理的HT22细胞显示出明显较弱的绿色荧光，表明tau蛋白表达降低（图4e）。与模型组（PBS + 冈田酸）相比，游离siRNA处理对tau蛋白敲低的影响最小，而HPPS使tau蛋白表达大幅降低约60%（图S14a，补充信息）。冈田酸（OKA）是一种常用的蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制剂，可诱导tau蛋白磷酸化。HT22细胞暴露于25 nM的OKA 8小时后，磷酸化tau蛋白苏氨酸231位点（p-tau-Thr231）和磷酸化tau蛋白丝氨酸404位点（p-tau-S404）的表达水平分别比对照组增加了2.4倍和2.1倍（图4d，图S14 b、c，补充信息）。tau蛋白水平的下降与p-tau-Thr231和p-tau-S404水平的显著降低相对应（图S14b、c）。重要的是，尽管HPPS处理使tau蛋白敲低近60%，但它并未干扰HT22细胞中的钙内流，HPPS处理组和PBS组之间相似的Fluo-4荧光强度证明了这一点（图S15，补充信息）。这一发现突出了HPPS的安全性，表明其tau蛋白沉默能力不会对神经元中的钙信号传导过程产生不利影响。

2.4 HPPS在体外和体内跨越血脑屏障（BBB）的评估和穿透性

在本研究中，我们评估了HPPS的安全性。通过尾静脉注射向健康小鼠给予PBS（100 μL）或HPPS（5 mg/mL，100 μL），随后进行1分钟的聚焦超声（FUS，0.6 MPa）处理，并联合使用浓度为1.5×10⁸/mL（100 μL）的微泡，靶向双侧海马区。在注射后的第3天、第7天和第14天，对主要器官，包括脑、肺、心脏、肝脏、脾脏和肾脏进行苏木精-伊红（HE）染色。结果显示，所有主要器官均未出现明显的病理变化（图5a）。此外，为了评估HPPS对肝肾功能的影响，我们测量了几种血液生化指标，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐和血尿素氮（BUN）。在这些参数方面，处理组和PBS对照组之间未观察到显著差异（图5b）。这些发现表明，HPPS在健康小鼠中表现出良好的生物相容性和安全性。对海马区进行的HE染色组织学检查显示，没有微血管破裂的迹象，这表明FUS（0.6 MPa）联合微泡是一种安全的操作方法。

图5：HPPS在体内外的安全性及跨越血脑屏障（BBB）能力的评估。a）健康小鼠在接受聚焦超声（FUS）联合微泡（MBs）辅助注射HPPS后两周内（第3天、第7天、第14天，HPPS = 20 mg/kg，0.1 mL）各器官组织切片的苏木精-伊红（HE）染色结果（n = 3个生物学独立样本）。b）HPPS注射后第3天、第7天、第14天小鼠的血液学检测结果（n = 3个生物学独立样本）。c）FUS联合MBs促进HPPS穿透血脑屏障的示意图。d）通过流式细胞术定量检测transwell下室中HT22细胞吞噬HPPS后Cy3的荧光强度（n = 3个生物学独立样本）。e）在FUS和MBs辅助下，用IR783标记的HPPS（IR783-HPPS）处理小鼠大脑后24小时内（10分钟、30分钟、1小时、2小时、12小时、24小时）的体内成像系统（IVIS）图像（n = 3个生物学独立样本）。f）尾静脉注射HPPS 1小时后小鼠大脑的离体荧光图像。小鼠分为两组：一组接受超声辅助，另一组不接受超声辅助。接受超声辅助的组又进一步细分为以下条件：左侧超声处理60秒、右侧超声处理60秒、两侧各超声处理30秒（n = 3个生物学独立样本）。数据以平均值±标准差表示。p < 0.0001，*p < 0.001，p < 0.01，*p < 0.05，ns：无显著性差异。

使用transwell系统构建血脑屏障模型，将小鼠脑内皮瘤细胞（bEnd.3）培养在上室，HT22细胞置于下室（图5c）。血脑屏障模型建立7天后，跨内皮电阻（TEER）达到200 Ω·cm⁻²（图S16a，补充信息）。血脑屏障组中荧光素钠（Na-Flu）的渗透系数为7.09 ± 1.018×10⁻⁵ cm/min，而对照组为15.14 ± 1.992×10⁻⁵ cm/min（图S16b，补充信息）。将Cy3标记的HPPS（Cy3-HPPS）添加到上室，并通过脱气水施加FUS，靶向transwell膜（图5c）。用0.6 MPa的能量联合浓度为1.5×10⁵/mL的微泡（MBs）对血脑屏障模型进行1分钟的照射。孵育6小时后，采用流式细胞术评估HT22细胞对HPPS的摄取情况。如图5d所示，FUS处理组（FUS+）的平均荧光强度约为未进行FUS处理组（FUS-）的1.6倍，表明FUS联合MBs增强了血脑屏障的通透性。

在体内实验中，将IRB-783标记的HPPS（IRB-783-HPPS，5 mg/mL，100 µL）与MBs（1×10⁸个气泡/mL，溶于100 µL PBS中）通过静脉注射共同给予小鼠，随后对海马区进行FUS处理。FUS促进了HPPS递送至海马区及周围脑区。体内成像系统（IVIS）显示，处理后1小时大脑荧光强度达到峰值（图5e）。小鼠大脑的离体IVIS图像显示，FUS处理1小时后有荧光分布，表明双侧FUS照射（单侧照射30秒，双侧共照射60秒）增加了海马区的纳米颗粒荧光强度（图5f）。将超声照射时间从60秒减少到30秒，目的是使材料的荧光集中在海马区，尽量减少其进入周围脑区。为了进一步评估FUS辅助递送后HPPS的器官分布情况，对大脑和肝脏中的荧光强度进行了定量分析。如图S17（补充信息）所示，在左侧和右侧海马区，大脑中的平均荧光强度（MFI）均显著高于肝脏。具体而言，大脑中的MFI约为肝脏的1.5倍，这表明在FUS介导的递送后，HPPS优先在大脑中积累（图S17，补充信息）。

如图S18a、b（补充信息）所示，与对照组相比，在参数（0.6 MPa，10 Hz，10%占空比，30秒）下接受FUS处理的小鼠体温升高幅度极小，两组的体温均在30秒内趋于稳定。同样，对HT22细胞进行的体外实验显示，温度升高幅度小于1℃，表明热效应可忽略不计（图S18c、d，补充信息）。这些结果表明，热效应不是FUS联合MBs打开血脑屏障的主要机制。

2.5 氢气释放剂在大脑中的代谢情况及tau蛋白沉默效率

无机纳米材料在大脑中的代谢特点是降解缓慢、持久性高且具有显著的生物稳定性。然而，这些特点也存在一定的缺点，例如难以完全清除、可能长期积累毒性以及存在神经毒性风险。[28] 这些因素限制了无机纳米材料在神经学应用中的安全性和可行性。因此，评估纳米药物从大脑中的清除率至关重要。脑部成像显示，单侧照射30秒（双侧共照射60秒）导致双侧海马区荧光强度富集（图5f）。对海马组织的免疫荧光分析表明，FUS促进了HPPS在海马区的积累，且小胶质细胞数量没有显著增加（图6a-c）。与神经元相比，HPPS在小胶质细胞中的共定位程度更高（图6d）。我们还监测了HPPS从大脑中的清除情况。免疫荧光分析显示，在给药后第3天，纳米颗粒的荧光强度降至第1天的一半，到第7天，降至初始强度的30%以下。这表明单次给药后，HPPS在海马区或相邻皮质区域内没有明显的代谢积累（图S19，补充信息）。

图6：在组织水平上验证HPPS向海马区的递送及其沉默tau蛋白的效率。a）注射后6小时，用Cy5.5标记的HPPS（Cy5.5-HPPS）处理的小鼠海马区的代表性免疫荧光图像。通过对NeuN（绿色）进行免疫染色来识别神经元，用lba-1（灰色）标记小胶质细胞。HPPS用Cy5.5（红色）标记，细胞核用DAPI（蓝色）染色（n = 3个生物学独立实验）。b）在DAPI标记的细胞群中Iba1⁺小胶质细胞的比例。c）Cy5.5-HPPS在海马区不同区域（CA1 = 海马体1区，CA3 = 海马体3区，DG = 齿状回）的平均荧光强度。d）Cy5.5-HPPS与神经元和小胶质细胞的共定位系数。e、f）海马区tau蛋白的免疫组织化学荧光定量分析以及每组（对照组（Con）、麻醉加手术组（A+S）、PBS组、siRNA组（S）、HPP组、HPPS组）注射后48小时的代表性图像（n = 3个生物学独立实验）。g）手术后第2天小鼠海马区tau蛋白和磷酸化tau蛋白的表达情况（n = 3个生物学独立实验）。h）手术后第2天海马区CA1区域活性氧（ROS）荧光的代表性二氢乙锭（DHE）染色结果（n = 3个生物学独立实验）。数据以平均值±标准差表示。p < 0.0001，*p < 0.001，p < 0.01，*p < 0.05，ns：无显著性差异。

氢气基因疗法治疗效果的初步证明是在手术后第2天海马区tau蛋白的下调，这表明了siRNA的有效性。利用FUS，HPPS在注射后48小时使海马区tau mRNA的表达降低了约50%（图S20a，补充信息）。免疫组织化学染色进一步证实了HPPS有效地沉默了tau蛋白的表达（图6e、f）。蛋白质免疫印迹（Western blotting）显示tau蛋白水平也有类似的约50%的降低（图6g，图S20b，补充信息）。海马区tau蛋白在S404和AT180位点的磷酸化水平也有所下降（图6g，图S20c、d，补充信息）。Western blot分析显示，在手术后第7天，未观察到tau蛋白敲低的治疗效果（图S21，补充信息）。

肝脏手术可能导致海马组织内ROS积累，激活小胶质细胞，并造成继发性损伤。我们评估了手术后第2天海马区ROS的产生情况。与对照组相比，麻醉和手术组导致海马区ROS水平显著升高，而HPP和HPPS处理可以逆转这种升高（图6h，图S22，补充信息）。

在FUS和MBs的辅助下，HPPS介导的tau siRNA递送表现出优异的tau蛋白沉默效果，支持了氢气基因疗法在减轻术后海马区神经炎症和认知障碍方面的作用。

2.6 氢气基因疗法的应用改善了小鼠神经行为测试中的术后行为表现

动物实验方案如图7a所示。用于评估空间记忆的莫里斯水迷宫（MWM）测试表明，HPPS显著增强了小鼠的空间学习和记忆能力。在手术前5天进行的水迷宫训练中，各组的逃避潜伏期和游泳速度达到了相似的水平，没有统计学上的显著差异（图7b、c）。在空间探索测试中，移除平台以评估小鼠对平台所在区域的探索情况，代表性的游泳轨迹如图7d所示。麻醉和手术组在目标象限停留时间减少以及穿越平台次数减少的情况，通过HPP和HPPS处理得到了恢复（图7e、f）。因此，MWM测试表明，部分肝切除术会损害小鼠的空间记忆，而HPP和HPPS对与术后认知功能障碍（POCD）相关的空间记忆缺陷具有预防治疗作用。

图7：异氟烷麻醉和部分肝切除术诱导小鼠出现POCD以及不同治疗药物（PBS、siRNA（S）、HPP、HPPS）的行为学影响。a）部分肝切除术后小鼠认知功能障碍行为测试的时间轴图。b、c）在莫里斯水迷宫（MWM）训练的5天中，隐藏平台测试中的平均逃避潜伏期和游泳速度（n = 10个生物学独立实验）。d）各组的代表性游泳轨迹。e、f）MWM测试中穿越平台的次数以及在目标象限的停留时间（n = 10只生物学独立的小鼠）。g）新物体识别测试（NOR）测试阶段的代表性运动轨迹和时间热图可视化结果。h）在NOR测试中与新物体互动的时间以及辨别指数（DI）（n = 10只生物学独立的小鼠）。i）旷场实验（OFT）的代表性运动轨迹和时间热图可视化结果。j）在旷场实验中在中心区域停留的时间（n = 10只生物学独立的小鼠）。数据以平均值±标准差表示。p < 0.0001，*p < 0.001，p < 0.01，*p < 0.05，ns：无显著性差异。

使用新物体识别（NOR）测试评估依赖于海马区CA3区域的识别记忆。识别指数（RI）反映了探索新物体的时间占总探索时间的比例，用于评估识别记忆。各组的代表性轨迹和时间热图反映了探索行为的差异（图7g），其中麻醉和手术组对新物体的位置没有明显的偏好倾向。与对照组相比，麻醉和手术组的小鼠对新物体位置的偏好显著降低（图7h，图S23，补充信息）。这些结果表明，麻醉和手术会损害小鼠的物体位置记忆。HPP和HPPS的预防性治疗恢复了小鼠对新物体识别的识别指数。在评估探索和运动活动的旷场实验（OFT）中，任何一组小鼠的总移动距离都没有显著减少，这表明各组之间的运动能力没有显著差异（图S24，补充信息）。然而，麻醉和手术组的小鼠在中心区域停留的时间更少，穿越中心区域的次数也更少，这表明经历异氟烷麻醉和部分肝切除术的小鼠存在认知障碍且焦虑增加。HPP和HPPS处理增加了小鼠在中心区域停留的时间和穿越中心区域的次数（图7i、j）。使用MWM、NOR和OFT进行的行为评估表明，HPP和HPPS对麻醉/手术诱导的小鼠认知障碍均有显著的预防作用，且HPPS表现出更优的疗效。

2.7 FUS辅助的氢气基因疗法减轻了海马区的神经炎症

如图8a所示，本研究通过免疫荧光双染法检测了手术后7天小鼠海马组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS，M1型小胶质细胞的标志物）和CD206（M2型小胶质细胞的标志物）的表达情况。与对照组相比，手术组海马区中指示小胶质细胞激活的离子钙结合蛋白1（Iba-1）荧光强度显著增加，Iba-1的Western blot分析也证实了这一点（图8b）。免疫荧光双染进一步区分了激活的小胶质细胞表型，结果显示，与对照组相比，麻醉和手术（A+S）组海马区CA1、CA3和DG区域中Iba1⁺/CD206⁺细胞显著增加（图8a，图S25a，补充信息），同时Iba1⁺/iNOS⁺细胞也有所增加（图8a，图S25b，补充信息）。用HPP或HPPS预处理显著减少了海马区Iba1⁺细胞的数量（图8a，图S25c，补充信息）。此外，HPPS预处理显著降低了Iba1⁺/iNOS⁺小胶质细胞的百分比，同时增加了Iba1⁺/CD206⁺小胶质细胞的百分比（图S25a、b，补充信息）。Western blot分析进一步证实了这一点（图8b，图S26a、b，补充信息）。高水平的ROS可以诱导并维持小胶质细胞的M1极化。[29] 先前的研究表明，tau蛋白聚集体与小胶质细胞受体（如 toll样受体）之间的相互作用会导致核因子κB（NF-κB）激活，促进促炎基因的转录，并使神经炎症循环持续下去。[30] 我们还研究了NF-κB信号通路，它是促炎（M1型）小胶质细胞表型的关键调节因子。[31] Western blotting显示，A+S组中该信号通路显著上调，HPP组中下调，而HPPS组中进一步受到抑制（图8b；图S26b，补充信息）。这些发现表明，HPPS减轻了POCD模型中小胶质细胞介导的神经炎症，抑制了M1极化，并促进了海马区小胶质细胞的M2极化，从而减轻了神经炎症。

图8：聚焦超声（FUS）辅助的氢气基因疗法减轻了海马体中的神经炎症。a）海马体中CD206（M2型小胶质细胞标志物，绿色）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS，M1型小胶质细胞标志物，绿色）的免疫荧光染色。离子钙结合蛋白1（Iba1，小胶质细胞标志物）染成红色，细胞核染成蓝色（对照组（Con）、麻醉加手术组（A+S）、磷酸盐缓冲液（PBS）组、小干扰RNA（siRNA）组（S）、HPP组、HPPS组）（n = 3个生物学独立实验）。b）不同组（对照组（Con）、麻醉加手术组（A+S）、PBS组、siRNA组（S）、HPP组、HPPS组）的Iba-1、iNOS、CD206、核因子κB（NF-κB）p65、磷酸化NF-κB p65（NF-κB p-p65）的蛋白质免疫印迹（Western blot）分析结果（n = 3个生物学独立实验）。c、d）不同实验组（对照组（Con）、麻醉加手术组（A+S）、HPPS联合FUS组（HPPS+FUS））在莫里斯水迷宫（MWM）测试中穿越平台的次数以及在第三象限停留的时间（n = 6只生物学独立的大鼠）。e）不同组（对照组（Con）、麻醉加手术组（A+S）、HPPS+FUS组）在MWM测试中的代表性游泳轨迹和时间热图可视化结果。f、g）不同组（对照组（Con）、麻醉加手术组（A+S）、HPPS+FUS组）在新物体识别（NOR）测试中与新物体和熟悉物体的互动时间（n = 6只生物学独立的大鼠）。h）不同组（对照组（Con）、麻醉加手术组（A+S）、HPPS+FUS组）在NOR测试阶段的代表性运动轨迹和时间热图可视化结果。数据以平均值±标准差表示。p < 0.0001，*p < 0.001，p < 0.01，*p < 0.05，ns：无显著性差异。

在手术后的第二天，我们证实了HPPS抑制了海马体中两种磷酸化tau蛋白的水平（图6g）。HPPS在抑制神经炎症方面表现出优于HPP的效果，这很可能是由于tau蛋白的敲低，从而打破了tau蛋白的病理循环。小胶质细胞的M1极化通常与促炎细胞因子的产生相关，这些细胞因子会加剧神经元损伤并损害认知功能。我们使用酶联免疫吸附测定（ELISA）法评估了海马体组织中这些细胞因子的表达，以评估HPPS对炎症蛋白水平的影响（图S27a-c）。与对照组相比，麻醉加手术组（A+S组）的促炎细胞因子水平升高，特别是白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。相反，HPP和HPPS都显著降低了这些炎症介质的表达，且HPPS的效果更佳（图S27a-c）。我们还通过免疫荧光染色定量检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞的数量，来评估海马体CA1区域中星形胶质细胞的激活情况（图S28，补充信息）。与对照组（Con）相比，A+S组中GFAP阳性星形胶质细胞的数量显著增加，这表明星形胶质细胞的激活程度升高。然而，与A+S组相比，HPPS处理显著减少了GFAP阳性细胞的数量，证明了它减轻星形胶质细胞激活的能力（图S28，补充信息）。基于以上结果，可以初步推断出，FUS辅助的携带tau siRNA的氢气释放剂能够减轻部分肝切除术后海马体的神经炎症。

2.8 氢气基因疗法对部分肝切除术后大鼠认知功能的影响

为了进一步验证HPPS对麻醉/手术诱导的认知障碍的预防和治疗效果，我们在10个月大的进行部分肝切除术的斯普拉格-道利（Sprague-Dawley）大鼠中进行了疗效重新评估。研究工作流程如图S29（补充信息）所示。通过给大鼠静脉注射HPPS（HPPS = 20 mg/kg）并使用FUS打开双侧海马体，我们通过免疫荧光法验证了三种tau-siRNA序列的敲低效率。在给药后48小时，siTAU2显示出最佳效果（图S30，补充信息）。蛋白质免疫印迹分析表明，与对照组相比，siTAU2组的tau蛋白水平显著降低，而siTAU3显示出中等效果（图S30，补充信息）。因此，选择siTAU2用于后续实验。在手术前5天，进行了MWM训练，对照组（Con）、A+S组和HPPS+FUS组在游泳速度和逃避潜伏期方面没有观察到显著的统计学差异（图S31a、b）。在手术后的第三天，开始进行空间探索测试。MWM测试显示，模型组穿越平台的频率和在第三象限停留的时间均有所减少，而HPPS预处理恢复了空间识别能力（图8c-e）。在NOR测试中，与熟悉物体相比，模型组与新物体的互动时间更少（图8f-h）。与模型组相比，超声辅助的氢气释放剂显著增强了大鼠对物体位置的识别能力（图8f-h），这表明手术和麻醉损害了物体识别能力，而氢气基因疗法减轻了麻醉/手术诱导的认知障碍。

3. 讨论

术后认知功能障碍（POCD）影响着成千上万的患者。它会损害患者的记忆力、注意力和执行功能。然而，目前缺乏有效的治疗方法。POCD的发病机制是由磷酸化tau蛋白、活性氧（ROS）和神经炎症过程之间的复杂相互作用驱动的。ROS在调节小胶质细胞极化方面起着关键作用。ROS水平升高会促进小胶质细胞处于促炎状态，从而加剧神经炎症。[32] 促炎性小胶质细胞会增强附近神经元中tau蛋白的磷酸化。[33] 过度磷酸化的tau蛋白会从微管上脱离并聚集成低聚物，形成神经原纤维缠结。积累的tau蛋白聚集体会分泌到细胞外空间，引发tau蛋白病变。[13] 研究表明，活化的小胶质细胞与病理性tau蛋白在大脑中的扩散有关。[13, 34] 炎症和tau蛋白磷酸化的循环形成了一个恶性循环的反馈回路，加剧了神经退行性变。[35] 打破这个循环需要抑制tau蛋白的磷酸化并清除过量的ROS，以减轻神经炎症。为了打破tau蛋白和ROS之间的恶性循环，我们开发了一种超声辅助的氢气释放剂，以实现基于氢气的基因疗法，用于预防麻醉/手术诱导的认知障碍。

氢气已被证明对解决各种健康问题有益，包括恶性肿瘤、心脏病、神经退行性疾病、代谢紊乱、糖尿病和皮肤损伤等。[17] 然而，氢气的高扩散性和有限的溶解度使其难以在特定靶点富集，从而限制了其治疗效果。将氢气与纳米材料相结合为解决这一限制提供了一种潜在的解决方案。[36] 硅烷（SiH），一种氢化的二维纳米片，能有效地减轻局部组织[21] 和结肠炎[37] 中的炎症。这表明通过SiH进行氢气治疗在抑制炎症方面是有效的。尽管如此，SiH纳米片在生物医学中的应用受到其在生理环境中溶解度和分散性差的限制。为了提高分散性和生物相容性，我们用不同比例的甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺（mPEG-d-PEI）对SiH进行了修饰。这种方法得到了分散良好的纳米片，能够在6小时内逐渐释放氢气，满足了治疗急性炎症的要求。

先前的研究表明，减少tau蛋白的磷酸化或清除tau蛋白聚集体可以减轻小胶质细胞的激活并减少神经炎症。[38] 研究显示，减少总tau蛋白可以降低其聚集，具有治疗效果。[39] 在本研究中，我们采用siRNA疗法在围手术期暂时降低总tau蛋白水平。siRNA疗法具有高度特异性基因沉默的优势，能够靶向调节与疾病相关的基因。尽管siRNA药物具有潜力，但其开发面临着一些关键挑战。这些挑战包括靶向富集、细胞摄取、内体和溶酶体逃逸以及药物性能等方面。[40] 在本研究中，我们使用纳米片递送siRNA。mPEG-d-PEI具有双重作用：它修饰SiH以增强其生物相容性和分散性，实现氢气的可控释放；同时，它将SiH的电荷变为正电荷，便于与带负电荷的siRNA结合。HPP对siRNA具有出色的保护作用。此外，聚乙烯亚胺（PEI）作为一种阳离子聚合物连接体，提高了溶解度，改善了细胞摄取，并促进了溶酶体逃逸，从而提高了治疗效果。[41] HPPS在细胞和组织环境中均表现出有效的tau蛋白沉默作用。

事实上，将无机纳米药物递送至大脑仍然是一个主要挑战，主要原因是血脑屏障（BBB）的限制特性阻碍了纳米药物的运输。在我们的研究中，我们通过超声辅助克服了血脑屏障，增强了药物在双侧海马体中的积累。微泡辅助的FUS可以暂时打开血脑屏障，为向大脑靶向递送药物提供了一种微创方法。[24, 42] 体内成像显示，FUS照射后1小时大脑荧光达到峰值。我们还评估了FUS诱导的血脑屏障打开的安全性，确保小鼠大脑中没有发生微出血。在FUS的辅助下，我们通过尾静脉注射成功地将HPPS递送至海马体。这些纳米片部分被小胶质细胞和神经元吞噬，实现了有效的tau蛋白敲低并抑制了磷酸化tau蛋白。这抑制了tau蛋白病变。NF-κB信号通路被下调，小胶质细胞的极化从M1型转变为M2型。这减轻了神经炎症，改善了行为和认知功能。我们的研究表明，通过重新平衡小胶质细胞极化的双靶点策略可以有效地减轻神经炎症。这项研究为预防麻醉/手术诱导的认知障碍提供了一种新方法。

总之，我们利用超声辅助的氢气释放剂进行氢气基因疗法，是一种有效且创新的策略，用于预防麻醉/手术诱导的认知障碍。通过打破tau蛋白和ROS的有害循环，这种方法可以显著减轻术后海马体中的神经炎症。这种治疗方法的意义不仅在于减少术后并发症，还在于提高患者的整体生活质量。此外，这种治疗策略为解决神经炎症性疾病提供了一个新的视角，并可能促进脑科学领域的发展。

4. 实验部分

化学试剂

硅化钙（CaSi₂）购自阿法埃莎（Alfa Aesar）公司。除非另有说明，所有其他化学试剂和测试试剂盒均购自西格玛-奥德里奇（Sigma–Aldrich）公司。杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，高糖型）、胎牛血清（FBS）、PBS以及青霉素/链霉素均购自中国上海的优比奥生物科技有限公司（YoBiBio）。抗tau蛋白抗体（A0002）、抗tau（404）抗体（AP0170）、抗β-肌动蛋白抗体（AC038）以及针对兔或小鼠的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（AS065）购自abconol公司。抗Iba-1抗体（17 198）、抗p65抗体（8242）、抗磷酸化p65抗体（3033）以及抗tau（231）（71 429）抗体购自赛默飞世尔科技（CST）公司，而抗iNOS抗体（PA1-036）和抗CD206抗体（MA5-16872）购自赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）公司。二氢乙锭（DHE）购自英杰维特分子探针公司（Invitrogen-Molecular Probes，尤金）。

表征方法

使用扫描电子显微镜（SEM，蔡司GeminiSEM 300）观察CaSi₂的形态。通过透射电子显微镜（TEM，JEM-2100F，日本电子株式会社）获得SiH纳米片的形态和元素映射图。使用马尔文Zetasizer Nanoseries纳米粒度仪（Nano ZS 960，英国马尔文仪器有限公司）测量动态光散射（DLS）和Zeta电位。使用布鲁克D8 X射线衍射仪进行X射线衍射（XRD）测试。应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，蔡司LSM900）拍摄共聚焦图像。使用流式细胞仪（BD LSR Fortessa）进行流式细胞术（FCM）分析。

SiH的合成

将0.5 g CaSi₂溶解在100 mL浓盐酸水溶液中，在零下20摄氏度下，使用磁力搅拌器以600转/分钟的速度搅拌10天。通过在10000转/分钟的速度下离心10分钟分离出绿色产物，随后用乙醇洗涤四次。将产物分散在50 mL乙醇中，然后在冰浴中进行36小时的探针超声处理。然后将混合物在15000转/分钟的速度下离心10分钟，以分离出具有所需小横向尺寸的SiH纳米片。

mPEG-PEI包裹的SiH的制备

按照先前研究中描述的方法合成甲氧基聚乙二醇-醛（mPEG-CHO）。[43] 在pH值为7.4的条件下，将PEI和mPEG-CHO以2:1的质量比混合30分钟，合成mPEG-d-PEI。将不同质量的SiH添加到所得溶液中，制备mPEG-d-PEI包裹的SiH。然后将所得的mPEG-PEI包裹的SiH与tau siRNA混合并孵育10分钟，以制备SiH@PP/siRNA（HPPS）。

琼脂糖凝胶电泳

将HPP/siRNA以各种质量比（0:1、3:1、5:1、10:1和15:1）共同孵育后，生成HPPS递送纳米系统。离心后，将沉淀物加载到2%（w/v）的琼脂糖凝胶上。电泳参数设置为80伏，持续25分钟。然后使用紫外灯和凝胶成像系统（Bio-Rad）对样品进行可视化观察。为了评估HPPS在核糖核酸酶（RNase）环境中的抗降解能力，将单独的siRNA（0.5 µg）或与HPP混合的siRNA与RNase共同孵育。在指定的时间点使用终浓度为2%的十二烷基硫酸钠（SDS）促进siRNA的释放。

HPPS结构的稳定性

为了提高生物相容性并实现氢气的可控释放，将不同质量比的SiH与PP混合。将所得的HPPS混合物与PBS、培养基混合，并在几个时间点（1分钟、1小时、3小时和6小时）拍摄实物照片，以确定最合适的比例。此外，拍摄与PBS反应6小时后产物的TEM图像，以观察残留结构。一旦确定了最佳比例，就在各种溶液（PBS、水、无血清培养基、FBS）中评估其稳定性和分散性，并使用DLS进一步分析。

HPP的氢气释放

使用气相色谱法对SiH和HPPS与磷酸盐缓冲液（PBS）反应过程中积累的气态氢气进行定量分析。氢气收集装置参考了游艳玲等人的文章[21]。

羟基自由基（·OH）清除活性

选择3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）作为显色底物来检测·OH的含量。首先将过氧化氢（H₂O₂，10 mM）和硫酸亚铁（FeSO₄，4 mM）反应0.5小时，然后加入不同浓度（0、25、50、100、200、400 µg/mL）的HPPS纳米片，反应0.5小时，最后加入TMB（0.6 mM）。在652纳米处测量吸光度（n = 3）。根据制造商的说明，使用基于2,2'-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基阳离子（ABTS⁺）脱色法的总抗氧化能力（TAC）检测试剂盒来测量HPPS的总抗氧化能力。采用电子自旋共振（ESR）光谱法，以5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作为捕获剂来评估HPPS的·OH清除活性。将芬顿试剂与HPPS（200和400 µg/mL）在PBS（pH 7.4）中混合，并在37°C下孵育5分钟，随后加入DMPO（25 mM）。

过氧化氢（H₂O₂，10 mM）分解产生·OH，·OH会进一步被对苯二甲酸（PTA，500 µM）捕获，生成具有强荧光的2-羟基对苯二甲酸（TAOH），在425纳米左右有发射峰。通过监测TAOH的荧光信号来评估H₂O₂的清除情况。使用紫外-可见-近红外分光光度计测定H₂O₂（10 mM）与HPPS（200 µg/mL）反应后的消耗量（每组n = 3）。

细胞培养和小鼠

从小鼠巨噬细胞系（BV2）、小鼠海马神经元细胞系（HT22）和小鼠脑微血管内皮细胞系（bEnd.3）购自中国典型培养物保藏中心（中国湖北武汉）。这些细胞在补充有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37°C、5%二氧化碳的环境中培养。雌性C57BL/6J小鼠（12-14个月大）购自灵畅生物科技有限公司。小鼠饲养在湿度和温度可控的房间内，光照/黑暗周期为12:12小时，可自由获取实验室的食物和水。所有动物实验程序均按照国家卫生部的规定进行，并获得了上海第十人民医院实验动物中心的批准（批准号：SHDSYY-2023-82278）。

细胞活力测定

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8），将BV2和HT22细胞与CCK-8溶液孵育2小时，并在450纳米处评估其活力。

HPPS纳米颗粒的细胞摄取和溶酶体逃逸分析

使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析Cy3标记的HPPS的细胞摄取情况。将BV2和HT22细胞以1×10⁵个细胞的密度接种到共聚焦聚焦培养皿中，培养8小时。将培养基中的HPPS加入BV2和HT22细胞中，并在不同时间（1、3、6小时）进行孵育（HPP = 200 µg/mL，siRNA = 25 nM）。然后分别加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，10 µg/mL）和溶酶体绿色荧光探针（Lysotracker，0.5 µg/mL）。

活性氧（ROS）清除和细胞保护

将HT22和BV2细胞以每皿1×10⁵个细胞的密度接种到20毫米的玻璃底细胞培养皿中。为了诱导ROS的产生，将芬顿试剂（400 µM H₂O₂和40 µM FeSO₄）加入培养基中。同时，将PBS、HPP、siRNA或HPPS（HPP = 200 µg/mL，siRNA = 25 nM）作为治疗剂加入，并孵育12小时。具体而言，使用对氧化剂敏感的荧光染料2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为细胞内ROS成像的ROS探针。此外，通过流式细胞术分析不同处理后染色细胞的细胞内ROS水平。此外，使用CLSM检查处理后HT22和BV2细胞的存活和死亡情况，分别用钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-AM）和碘化丙啶（PI）对活细胞和死细胞进行染色。

对细胞中三种成分的保护作用

分别通过2,4-二硝基苯肼（DNPH）法、C11-BODIPY581/591染料、磷酸化组蛋白H2AX免疫荧光染色来评估蛋白质羰基化、脂质过氧化和DNA损伤情况。

BV2细胞极化

用脂多糖（LPS，1 µg/mL）诱导BV2细胞，并用siRNA、HPP和HPPS（HPP = 200 µg/mL，siRNA = 25 nM）处理12小时。将BV2细胞在1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS缓冲液中于室温下染色20分钟。使用以下抗体：别藻青蛋白（APC）标记的CD16/32和藻红蛋白（PE）标记的CD206（biolegend公司）。采用流式细胞术分析M1型小胶质细胞的比例。此外，根据制造商的说明，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测量海马体和培养基中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的浓度。

体外基因沉默实验

tau小干扰RNA（小鼠）：5'-CCU AGA AAU UCC AUG ACG AUU-3'；tau小干扰RNA（大鼠）：siTAU1：5'-GCAUGUGACUCAAGCUCGA-3'；siTAU2：5'-AGUUAGGGACGAUGCGGUA-3'；siTAU3：5'-GAUAGAGUCCAGUCGAAGA-3'；用冈田酸（OKA，25 nM）处理HT22细胞8小时，以建立磷酸化模型。然后将细胞分为五组：对照组、OKA组、仅OKA + siRNA组、OKA + HPP组和OKA + HPPS组（siRNA浓度为25 nM）。孵育36小时后，按照制造商的方案使用Trizol试剂提取细胞总RNA，并用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液裂解细胞后收集总蛋白。使用实时荧光定量PCR和免疫荧光检测靶基因tau的表达。此外，采用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析检测靶蛋白和磷酸化tau蛋白的表达。使用的引物如下：tau正向引物：5'-TTTGACACAATGGAAGACCATGC-3'；tau反向引物：5'-GCCACACGAGCTTTTAAGCC-3'。

体外聚焦超声（FUS）打开血脑屏障（BBB）实验

使用全自动CellZscope设备在第1天至第7天测量血脑屏障模型的跨内皮电阻（TEER），以无细胞的transwell小室作为空白对照。TEER（Ω·cm²）=（实验组电阻值 - 空白组电阻值）×膜面积（cm²）。将bEnd.3细胞以每孔700,000个细胞的密度接种在带有0.4微米孔径聚碳酸酯膜的transwell培养小室的底部。每天使用上皮伏特-欧姆表测量TEER，直到1周后其稳定在约80欧姆·厘米²左右，此时进行通透性实验。使用酶标仪测量通过血脑屏障模型的荧光素钠（Na-flu）的量，并使用Artursson公式计算其通透性。然后将HT22细胞接种在小室的下层，使用通过功率放大器放大的换能器施加FUS以穿透transwell膜。4小时后，通过流式细胞术检测HT22细胞中Cy3标记的HPPS（Cy3-HPPS，HPP = 200 µg/mL，siRNA = 25 nM）的荧光强度。

体内安全性评估

给小鼠（n = 9）静脉注射溶解在生理盐水中的HPPS（25 mg/kg，5 mg/mL），而对照组小鼠（n = 3）接受PBS注射，两组均接受FUS联合微泡（MBs，1×10⁸个气泡/mL，溶于100 µL PBS中）处理。在处理后的第3天、第7天和第14天，取出HPPS组小鼠的主要器官，固定后进行苏木精-伊红（HE）染色，以便进行显微镜评估。采集血液样本以评估肝肾功能参数。以PBS组作为对照，在给药后的第三天采集器官和血液样本。

体内FUS打开血脑屏障实验

为了研究使用FUS打开血脑屏障的情况，使用由连接到功率放大器的函数发生器操作的FUS换能器（1.0 MHz，直径38毫米）。换能器置于一个充满脱气水的圆锥体中，将FUS光束导向大脑，参数设置为声压0.6 MPa、脉冲重复频率10 Hz和占空比10%。当进行单侧照射时，超声持续时间设置为60秒；对于双侧照射，每侧持续时间限制为30秒。小鼠海马体相对于前囟的坐标为：前后（AP）-2.0毫米、内外侧（ML）±1.5毫米、背腹侧（DV）-1.5毫米。对小鼠头部进行剃毛和脱毛处理后，将其固定在立体定位框架上，在暴露于FUS之前，给小鼠注射IRB783标记的HPPS（25 mg/kg，5 mg/mL，siRNA = 100 nmol/kg）和微泡（1×10⁸个气泡/mL，溶于100 µL PBS中）。在FUS处理后的10分钟、30分钟、1小时、2小时、12小时和24小时，使用光谱成像系统进行脑部成像。使用IVIS Living Image软件对成像数据进行处理和分析。

大鼠海马体相对于前囟的坐标为：AP（前后）-3.0毫米、ML（内外侧）±2.0毫米、DV（背腹侧）-3.0毫米。大鼠海马体两侧的超声照射强度设置为0.6 MPa，每侧持续时间增加到1分钟（HPPS = 20 mg/kg）。在超声暴露后，立即使用红外热成像监测处理（FUS+）和未处理（FUS-）区域的皮肤表面温度。使用红外热像仪拍摄热图像，并记录处理部位的温度。

麻醉和部分肝切除术

在一个专用的腔室中使用3%异氟烷和60%氧气进行麻醉并维持麻醉状态。暴露于异氟烷30分钟后，对小鼠的腹部区域进行剃毛并用聚维酮碘消毒。手术过程约30分钟，包括在腹部正中做一个1厘米的切口以进入腹腔。用4-0无菌缝合线在肝脏的中叶和左叶（占肝脏总量的70%）的基部进行结扎[44]。然后用剪刀切除这些肝叶，并观察伤口以确保没有明显的出血。关闭腹膜和皮肤，并在伤口上涂抹多粘菌素以防止感染。在手术过程中使用加热垫将体温保持在36至37°C之间。在诱导麻醉后和切开前给予丁丙诺啡（0.1 mg/kg）以减轻疼痛。对照组小鼠不进行麻醉或手术。大鼠的肝切除手术过程与小鼠相似。

动物行为实验——莫里斯水迷宫（MWM）

按照Ariel K. Frame等人建立的方案[45]，使用莫里斯水迷宫（MWM）评估空间学习和记忆能力。实验使用一个较小的水池，直径120厘米，高30厘米，在水下放置一个隐藏的平台。连续5天每天进行4次训练试验，随后进行一次60秒的测试以找到平台。对于大鼠实验，使用一个更大的水池，直径180厘米，深50厘米，以满足研究的需要。

新物体识别（NOR）

对新物体识别（NOR）测试进行了改进[46]，包括三个阶段：适应期、训练期和测试期。在适应期（第1天），小鼠在一个空的腔室中适应5分钟。在训练期（第2天），小鼠在腔室中探索两个相同的物体5分钟。在测试日（第3天），将一个熟悉的物体替换为一个新物体，并观察小鼠5分钟，使用Visutrack软件计算辨别指数（DI），该指数通过测量小鼠与新物体和熟悉物体的互动时间来评估。

旷场实验

按照马俊星等人的方法[47]，在一个盒子（50厘米×50厘米×50厘米）中进行旷场实验（OFT）。使用Visutrack软件（中国上海欣软信息科技有限公司）自动记录不动时间和在中心区域停留的时间。

二氢乙锭（DHE）染色

使用原位DHE荧光染色评估海马体区域的细胞内ROS水平。将组织切片用在PBS中稀释的1 µM DHE溶液处理，并在室温下孵育40分钟。使用ImageJ软件分析图像密度。

免疫荧光染色

为了了解小鼠海马体中小胶质细胞的激活和极化情况，通过免疫荧光检测M1型和M2型小胶质细胞的标志物。将大脑冠状切片（20微米厚）与5%山羊血清孵育以阻断非特异性结合，然后与抗Iba-1抗体和兔抗CD206抗体或抗iNOS抗体在4°C下孵育过夜。

Western blot分析

从小鼠海马体和HT22细胞中提取蛋白质用于免疫印迹分析。使用以牛血清白蛋白（BSA）为标准的Bio-Rad蛋白质测定试剂盒对提取的蛋白质浓度进行定量。将等量的每个蛋白质样品加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上进行分离，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将这些膜与一抗在4°C下孵育过夜，随后应用荧光二抗。

统计分析

数据以平均值±标准差表示。通过GraphPad Prism软件（版本9.0.0，GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析。对于多组比较，使用单因素方差分析（ANOVA）。对于两组比较，使用非配对Student's t检验。*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001，p < 0.0001，ns表示p > 0.05。