氢气减轻瘙痒机制的研究

题目：氢气通过SIRT1-β-连环蛋白通路抑制脊髓氧化应激和突触可塑性，从而减轻小鼠皮炎性瘙痒、糖尿病性瘙痒和胆汁淤积性瘙痒

摘要

慢性瘙痒主要与皮肤病、全身性疾病或代谢紊乱相关，目前大多数止痒药物往往对其疗效不佳，这凸显了改进治疗方法的必要性。氧化损伤是脊髓瘙痒致敏和突触可塑性的一个新的决定性因素。氢气缓解氧化损伤的作用已得到证实。在此，我们令人惊讶地发现，吸入氢气（2%）和腹腔注射富氢盐水（5毫升/千克）均可预防和缓解持续性的皮炎性瘙痒、糖尿病性瘙痒和胆汁淤积性瘙痒。氢气疗法可逆转皮炎、糖尿病和胆汁淤积后脊髓中SIRT1表达的降低以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶）活性的下降。此外，在持续性瘙痒模型中，氢气可减少脊髓活性氧（ROS）的产生、氧化产物（丙二醛、8-羟基脱氧鸟苷和3-硝基酪氨酸）的积聚、β-连环蛋白的乙酰化以及树突棘密度。脊髓中SIRT1受到抑制会消除氢气的止痒和抗氧化作用，而SIRT1激动剂可减轻慢性瘙痒表型、脊髓β-连环蛋白乙酰化以及线粒体损伤。β-连环蛋白抑制剂可通过减少β-连环蛋白乙酰化、阻断细胞外调节蛋白激酶（ERK）磷酸化以及提高抗氧化酶活性来有效对抗慢性瘙痒。氢气处理可抑制体外由皮炎和胆汁淤积介导的自发性兴奋性突触后电流。此外，氢气可削弱胆汁淤积诱导的右侧初级扣带回皮质与双侧感觉运动皮质以及双侧纹状体之间大脑功能连接性的增强。综上所述，本研究揭示了在小鼠中氢气通过上调依赖SIRT1的β-连环蛋白去乙酰化来减轻氧化损伤，进而预防慢性瘙痒和脊髓瘙痒致敏，这意味着在转化研发中控制瘙痒的一种有前景的策略。

1. 引言

瘙痒是一种常见的令人不适的感觉，会引发搔抓反射[1,2]。急性瘙痒作为一种针对可能有害刺激物的警示和自我防御机制，而慢性瘙痒则是一个使人衰弱的临床问题，大约影响8% - 25.5%的人群，其主要由皮肤病（过敏性接触性皮炎、银屑病）、全身性疾病（胆汁淤积、慢性肾衰竭）以及代谢病因（糖尿病）引起[3,4,5,6,7,8]。尽管搔抓行为能暂时缓解瘙痒，但持续的“瘙痒 - 搔抓 - 瘙痒”循环通常会导致严重的皮肤损伤、睡眠障碍、神经认知功能障碍以及精神共病（焦虑和抑郁）[9,10,11,12,13]。尽管瘙痒在临床上很重要，但与疼痛等其他躯体感觉模式不同，人们对其发病机制和治疗方案的了解还远远不够。

实验研究的最新进展增加了我们对脊髓层面瘙痒感知和传导的神经回路及神经调节因子的理解[14,15,16]。慢性瘙痒的产生和维持可能源于脊髓瘙痒致敏，这代表了脊髓背角神经元及其回路具有相当大的神经可塑性[17,18,19]。氧化损伤已被确定为脊髓伤害性和瘙痒性致敏以及兴奋性感觉突触可塑性的一个新的决定性因素[20,21,22,23]。然而，慢性瘙痒背后的详细分子机制仍不清楚。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）依赖的组蛋白去乙酰化酶——沉默调节蛋白（SIRTs）1 - 7，通过使一系列组蛋白和非组蛋白去乙酰化，被认为是调节多种病理生理过程（包括氧化应激、炎症、自噬、衰老和凋亡）的关键信号分子[24,25,26,27,28]。在慢性疼痛的情况下，SIRT1表达降低是钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα（CaMKIIα）乙酰化的一个关键特征，与神经损伤诱导的疼痛及易出现的情绪障碍的发展有关[29]。脊髓SIRT2通过使叉头框蛋白O3a（FoxO3a）去乙酰化来缓解骨癌疼痛[30]。此外，在啮齿动物中，脊髓中SIRT3的激活通过使锰超氧化物歧化酶（MnSOD）去乙酰化来控制角叉菜胶诱导的炎性疼痛[31]。由于疼痛和瘙痒具有某些相似的神经回路，我们探究了SIRTs的修饰是否以及如何参与不同病因的慢性瘙痒。

在过去的十年中，医用气体氢气在减轻和消除氧化损伤及炎症方面取得了重大进展，且其毒性很小[32,33]。有趣的是，氢气在众多神经系统疾病（包括缺血性脑卒中、创伤性脑损伤、多发性硬化症、术后谵妄、阿尔茨海默病、帕金森病、焦虑和抑郁）中展现出了出色的神经保护作用和治疗潜力[34,35]。此外，氢气疗法对阿片类药物诱导的痛觉过敏[36,37]、足底切口术后疼痛[38]、化疗诱导的神经性异常性疼痛[39]以及吗啡诱导的镇痛耐受[40]动物的感觉神经元兴奋性和脊髓伤害性致敏有效。然而，氢气是否以及如何减轻慢性瘙痒仍不清楚。

在这项临床前研究中，我们利用三种小鼠模型（包括过敏性接触性皮炎诱导的瘙痒、糖尿病性瘙痒以及胆汁淤积性瘙痒）确定了氢气在慢性瘙痒中的止痒作用及治疗靶点。由于大脑最终负责产生瘙痒的有意识感觉[9,12,13,19]，评估氢气在慢性瘙痒状态下对大脑的止痒作用可能会让我们更深入地了解成功的止痒疗法是如何起效的。在此，我们利用静息态功能磁共振成像（fMRI）来评估胆汁淤积性瘙痒中的全脑功能连接性。总体而言，我们的研究结果可能为控制瘙痒提供有前景的途径，并阐明瘙痒慢性化的新型神经生物学机制。

2. 结果

2.1. 过敏性接触性皮炎诱导慢性瘙痒并降低脊髓背角中SIRT1的表达

为了探究SIRTs在慢性瘙痒中的潜在参与情况，我们采用了过敏性接触性皮炎模型（图1A）。首先，接受二硝基氟苯（DNFB）干预的动物出现了严重的皮肤损伤，包括皮肤红斑、水肿、溃疡和结痂（图1B）。此外，与用橄榄油处理的对照小鼠相比，应用二硝基氟苯引发了搔抓活动快速（<3天）且持久（>9天，观察的最后一天）的增加（F₁,₇₀ = 1267，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图1C），这表明皮炎后成功引发了慢性瘙痒且瘙痒持续存在。有趣的是，在SIRTs 1 - 7中，我们仅观察到与正常小鼠相比，经皮炎处理的小鼠脊髓背角中SIRT1表达显著降低（F₂,₁₂ = 96.48，P < 0.0001，n = 5，单向方差分析，图1D和E）。在接触二硝基氟苯后，脊髓SIRT1活性也下调了（F₂,₁₂ = 111.9，P < 0.0001，n = 5，单向方差分析，图1F）。同时，为了确定脊髓背角中SIRT1所在的细胞类型，我们利用免疫组织化学方法分别检测了SIRT1与神经元标志物神经元核抗原（NeuN）、小胶质细胞标志物离子钙结合衔接分子1（IBA - 1）以及星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的共定位情况。双重染色显示，SIRT1与神经元核抗原（NeuN）大量共定位，但与离子钙结合衔接分子1（IBA - 1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）并不共定位，这表明脊髓背角神经元是SIRT1的主要表达细胞（图1G）。这些数据意味着脊髓SIRT1可能通过神经元调节在慢性瘙痒中发挥关键作用。

图1. 过敏性接触性皮炎诱导小鼠慢性瘙痒并降低脊髓SIRT1的表达及活性。

(A) 二硝基氟苯（DNFB）诱导的皮炎瘙痒小鼠模型的实验设计方案。该图由BioRender软件绘制。

(B) 二硝基氟苯干预后3天和7天颈部皮肤外观图像。

(C) 二硝基氟苯暴露后的搔抓次数。每组n = 8只小鼠。与对照组相比，****P < 0.0001。

(D和E) 蛋白免疫印迹法显示二硝基氟苯干预后3天和7天脊髓背角中SIRTs 1 - 7的表达情况。每组n = 5只小鼠。与空白组相比，****P < 0.0001。

(F) 二硝基氟苯干预后3天和7天脊髓背角中SIRT1的活性受到抑制。每组n = 5只小鼠。与空白组相比，****P < 0.0001。

(G) 脊髓背角中SIRT1（红色）与不同细胞标志物（绿色）——神经元（NeuN）、小胶质细胞（IBA - 1）和星形胶质细胞（GFAP）的双重染色。比例尺为100μm。数据以平均值±标准差表示，并通过双向方差分析及邦费罗尼事后检验（C）、单向方差分析及邦费罗尼事后检验（E、F）进行分析。

2.2. 脊髓SIRT1级联反应对于皮炎诱导的慢性瘙痒是必需的

为了确定SIRT1激活是否以及在何处会减轻持续性瘙痒，在二硝基氟苯暴露后的第0至2天，分别通过腹腔注射（i.p.）、皮内注射（i.d.）和鞘内注射（i.t.）途径重复给予特异性SIRT1激活剂SRT1720（图2A）。我们首先发现，三次腹腔注射SRT1720（剂量分别为10、20和50mg/kg）以剂量依赖的方式减少了二硝基氟苯诱导的搔抓行为（F(3, 140) = 18.45，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图2B），且其显著的止痒效果在第三次治疗后持续了3天。然而，重复皮内注射SRT1720（剂量分别为10、50、100μg）未能改善类似瘙痒的搔抓行为（F(3, 140) = 2.538，P = 0.0591，n = 8，双向方差分析，图2C）。引人注目的是，接受重复鞘内注射SRT1720（剂量分别为1、5和10μg）的小鼠搔抓活动减少（F(3, 140) = 23.14，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图2D）。此外，通过转棒测试评估发现，鞘内重复注射SRT1720并未影响皮炎小鼠的运动能力（图2E），这表明通过脊髓途径给予SRT1720预防瘙痒并非是由于运动功能缺陷所致。这些详细数据表明，脊髓SIRT1激活足以减轻慢性瘙痒感知。

图2. 脊髓SIRT1激活可减轻小鼠皮炎诱导的慢性瘙痒及脊髓β-连环蛋白乙酰化。

(A) 在二硝基氟苯诱导瘙痒的小鼠模型中，通过腹腔注射（i.p.）、皮内注射（i.d.）、鞘内注射（i.t.）测试SIRT1激活剂SRT1720止痒效果的实验设计。该图由BioRender软件绘制。

(B) 预先腹腔注射SRT1720以剂量依赖的方式减轻了皮炎诱导的搔抓行为。每组n = 8只小鼠。

(C) 预先皮内注射SRT1720未减轻皮炎诱导的搔抓行为。每组n = 8只小鼠。

(D) 预先鞘内注射SRT1720以剂量依赖的方式减轻了皮炎诱导的搔抓行为。每组n = 8只小鼠。

(E) 通过转棒测试评估的运动功能未因三次鞘内注射SRT1720而受损。每组n = 6只小鼠。

(F和G) 蛋白免疫印迹法显示二硝基氟苯干预后3、5、7和9天脊髓背角中β-连环蛋白表达及乙酰化的动态变化。每组n = 5只小鼠。与空白组相比，****P < 0.0001。

(H和I) 蛋白免疫印迹法显示，鞘内注射SRT1720（10μg）在二硝基氟苯干预后3天可增加SIRT1的表达并降低β-连环蛋白乙酰化。每组n = 5只小鼠。

(J) 二硝基氟苯干预后3天SIRT1活性的降低可通过SRT1720得到提升。每组n = 5只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过双向方差分析及邦费罗尼事后检验（B - E）、单向方差分析及邦费罗尼事后检验（G、I、J）进行分析。

2.3. 脊髓SIRT1激活抑制皮炎诱导的β-连环蛋白乙酰化及氧化应激

脊髓背角中WNT/β-连环蛋白信号通路的激活已逐渐被认为是病理性疼痛发展过程中神经元兴奋性及突触可塑性的关键步骤[41, 42]。此外，β-连环蛋白的过度活跃取决于其乙酰化/去乙酰化修饰[43, 44]。鉴于β-连环蛋白是SIRT1去乙酰化作用的关键下游靶点[45, 46, 47]，我们进一步探究了SIRT1和β-连环蛋白在瘙痒神经回路中的可能相互作用。有趣的是，我们检测到皮炎后β-连环蛋白乙酰化（而非表达量）迅速且持续增加（F₈,₃₆ = 103.8，P < 0.0001，n = 5，单向方差分析，图2F和G），这与慢性瘙痒行为的时间进程十分吻合。更重要的是，鞘内给予SRT1720（10μg）可增加SIRT1的表达及活性，并降低β-连环蛋白的乙酰化水平（图2H - J）。同时，SRT1720抑制了活性氧（ROS）的生成（图3A和B），减少了氧化修饰分子（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚（图3C - E），并上调了脊髓背角中抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，图3F - H）的活性。此外，利用透射电子显微镜检测了背角神经元线粒体的超微结构变化（图3I）。对照组动物的线粒体结构完整。皮炎小鼠的神经元线粒体明显肿胀且解体，经SRT1720治疗后有所改善。这些研究结果均表明，脊髓中SIRT1表达及活性的下调通过增加β-连环蛋白乙酰化、抑制抗氧化酶活性以及造成氧化损伤，从而促成了皮炎诱导的慢性瘙痒。

图3. 脊髓SIRT1激活可减轻小鼠皮炎诱导的脊髓氧化应激。

在二硝基氟苯暴露后的第0至2天，每天进行三次鞘内注射SRT1720（10μg）。在二硝基氟苯暴露后第3天收集脊髓背角组织。

(A和B) 二氢乙啶（DHE）染色检测到SRT1720减少了脊髓活性氧的生成。每组n = 5只小鼠。比例尺为50μm。

(C - E) 酶联免疫吸附测定（ELISA）显示SRT1720减少了脊髓氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚。

(F - H) SRT1720逆转了脊髓背角中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低。每组n = 5只小鼠。

(I) 利用透射电子显微镜检查背角神经元线粒体的超微结构变化。对照组动物的线粒体结构完整（绿色箭头）。皮炎小鼠的神经元线粒体明显肿胀且解体（蓝色箭头），经SRT1720治疗后有所改善。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验（B - H）进行分析。

2.4. 氢气通过依赖脊髓SIRT1的β-连环蛋白去乙酰化作用预防并减轻皮炎诱导的慢性瘙痒

基于氢气的诸多优势，包括具有选择性抗氧化特性[32, 48]、能有效增强SIRT1活性[49, 50]以及应用成本低且无副作用[33]，我们随后探究了氢气对瘙痒表型以及SIRT1 - β-连环蛋白轴的影响。在二硝基氟苯（DNFB）暴露后，每天吸入低浓度（2%）氢气1小时，持续3天（图4A）。尽管氢气疗法并未改善二硝基氟苯所致的严重皮肤损伤（图4B）以及受累皮肤表皮厚度的增加（图4C和D），但在初期进行氢气预处理可极大地预防皮炎诱导的搔抓行为，且预防效果持续超过5天（F₁,₇₀ = 50.29，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图4E）。此外，我们还测试了在已出现瘙痒症状时使用氢气进行后处理的治疗潜力。有趣的是，在二硝基氟苯干预后的第7天（后期）单次吸入氢气，能迅速且显著地减轻已形成的慢性瘙痒（P = 0.0002，n = 8，双侧t检验，图4F）。然而，我们并未观察到雄性和雌性小鼠在二硝基氟苯诱导的搔抓行为以及氢气止痒效果方面存在性别差异（图S1A）。

图4. 吸入氢气可减轻小鼠皮炎诱导的慢性瘙痒，但对皮炎无改善作用。

(A) 在二硝基氟苯诱导瘙痒的小鼠模型中测试氢气止痒效果的实验设计。该图由BioRender软件绘制。

(B) 二硝基氟苯干预及吸入氢气3天后颈部皮肤外观图像。

(C和D) 苏木精 - 伊红（H&E）染色显示，二硝基氟苯干预后皮炎皮肤的表皮（↓）厚度不受吸入氢气的影响。比例尺为50μm。每组n = 5只小鼠。与对照组相比，****P < 0.0001。

(E) 吸入氢气预处理可抑制皮炎诱导的搔抓行为产生。每组n = 8只小鼠。

(F) 在二硝基氟苯暴露后第7天吸入氢气1小时可减轻已存在的持续性瘙痒。每组n = 8只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验（D）、双向方差分析及邦费罗尼事后检验（E）以及非配对双侧t检验（F）进行分析。

更引人注目的是，我们的生化实验（图5A - K）发现，吸入氢气可提升二硝基氟苯暴露后第3天皮炎所致的脊髓抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）活性下降、SIRT1表达及活性降低的情况（图5F - K）。与此同时，吸入氢气可抑制皮炎小鼠中活性氧（ROS）生成量的增加（图5A和B）、氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚（图5C - E）以及β - 连环蛋白的乙酰化（图5I和J）。这些详细结果意味着氢气疗法可能通过调节脊髓SIRT1 - β - 连环蛋白介导的氧化应激来控制皮炎诱导的慢性瘙痒。

图5. 吸入氢气可减轻皮炎小鼠脊髓背角中依赖SIRT1的β - 连环蛋白乙酰化及氧化应激。

在二硝基氟苯暴露后的第0至2天，每天重复吸入2%的氢气1小时。在二硝基氟苯干预3天后收集脊髓组织用于生化实验。

(A和B) 二氢乙啶（DHE）染色检测到氢气可减少脊髓活性氧的生成。比例尺为50μm。

(C - E) 酶联免疫吸附测定（ELISA）显示氢气可减少脊髓氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚。

(F - H) 氢气逆转了脊髓背角中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低。

(I和J) 蛋白免疫印迹法显示，吸入氢气可增加二硝基氟苯干预后SIRT1的表达并降低β - 连环蛋白乙酰化。

(K) 二硝基氟苯干预后SIRT1活性的降低可通过吸入氢气得到逆转。每组n = 5只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验（B - H、J和K）进行分析。

2.5. 氢气减轻糖尿病小鼠的慢性瘙痒，增加脊髓SIRT1表达并促进β - 连环蛋白去乙酰化

糖尿病患者中慢性瘙痒的患病率为18.4% - 43.0%，是非糖尿病人群的2.7倍[23, 51]，这凸显了深入研究糖尿病性瘙痒的具体发病机制及治疗策略的紧迫性。鉴于超过90%的糖尿病病例为2型糖尿病（T2DM）[52]，我们进一步利用高脂饮食喂养/链脲佐菌素（STZ）注射诱导的2型糖尿病小鼠模型来检验氢气对糖尿病性瘙痒的有益作用。

与对照小鼠相比，经链脲佐菌素处理的小鼠空腹血糖（FBG）水平显著升高（表S1），这表明2型糖尿病模型成功建立。然后，在链脲佐菌素注射后，每天吸入2%的氢气1小时，持续3天（图6A）。与2型糖尿病小鼠相比，我们未检测到吸入氢气后空腹血糖水平有任何变化（表S1），这意味着氢气对2型糖尿病并无有益影响。然而，氢气预处理可显著减少2型糖尿病诱导的搔抓活动（F₁,₇₀ = 35.06，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图6B）。同样，在链脲佐菌素注射3周后用2%氢气进行后处理，可使已形成的慢性瘙痒出现统计学意义上的显著减轻（P = 0.0016，双侧t检验，图6C）。而且，氢气对糖尿病瘙痒行为的治疗效果在不同性别间并无差异（图S2）。

图6. 吸入氢气可减轻小鼠脊髓背角中糖尿病性瘙痒、依赖SIRT1的β - 连环蛋白乙酰化及氧化应激。

(A) 在链脲佐菌素诱导的糖尿病瘙痒小鼠模型中测试氢气止痒效果的实验设计。该图由BioRender软件绘制。

(B) 吸入氢气预处理可抑制糖尿病诱导的搔抓行为产生。每组n = 8只小鼠。

(C) 在链脲佐菌素暴露后第21天吸入氢气1小时可减轻已存在的持续性瘙痒。每组n = 8只小鼠。

(D和E) 二氢乙啶（DHE）染色检测到氢气可减少脊髓活性氧的生成。比例尺为50μm。

(F - H) 酶联免疫吸附测定（ELISA）显示氢气可减少脊髓氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚。

(I - K) 氢气逆转了脊髓背角中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低。

(L和M) 蛋白免疫印迹法显示，吸入氢气可增加链脲佐菌素干预后SIRT1的表达并降低β - 连环蛋白乙酰化。

(N) 链脲佐菌素干预后SIRT1活性的降低可通过吸入氢气得到逆转。每组n = 5只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过双向方差分析及邦费罗尼事后检验（B）、非配对双侧t检验（C）以及单向方差分析及邦费罗尼事后检验（E - K、M和N）进行分析。

有趣的是，氢气预处理抑制了糖尿病小鼠脊髓中活性氧生成量的增加（图6D和E）以及氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚（图6F - H）。同时，吸入氢气可有效逆转糖尿病瘙痒小鼠中抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）活性、SIRT1表达及活性在脊髓中的下调情况（图6I - N）。氢气还抑制了2型糖尿病小鼠脊髓背角中β - 连环蛋白乙酰化的增加（图6L和M）。这些结果表明，在2型糖尿病诱导的周围神经病变（糖尿病性瘙痒）中，SIRT1 - β - 连环蛋白级联反应参与了氢气疗法的止痒作用。

2.6. 氢气疗法通过依赖脊髓SIRT1的β-连环蛋白去乙酰化作用对胆汁淤积性瘙痒有效

大约80% - 100%的胆汁淤积性黄疸患者也会经历慢性瘙痒，这是胆汁淤积性肝病常见的合并症及表现形式[3, 6]。为了随后评估氢气在胆汁淤积性瘙痒中的保护作用，在胆管结扎（BDL）手术后的第11至13天，每天吸入2%的氢气1小时（图7A）。胆管结扎手术后第14天，通过检测到血清总胆红素水平升高以及耳部、皮肤、后爪变黄以及肝脏组织变黄，验证了胆汁淤积模型成功建立（图7B和C）。苏木精 - 伊红（H&E）染色还显示胆管结扎手术后出现了小胆管纤维化、扩张和新生以及肝细胞肿胀的情况（图7D）。令人惊讶的是，吸入氢气对胆汁淤积诱导的搔抓活动产生了持久且显著的抑制作用，这种抑制作用持续了一周多（F₁,₇₀ = 50.58，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图7E）。同时，我们未观察到两性之间在胆汁淤积性瘙痒以及氢气止痒效果方面存在性别差异（图S3）。此外，在胆管结扎手术后第21天单次吸入氢气可显著抑制已有的搔抓行为（P = 0.0008，双侧t检验，图7F）。另外，氢气预处理逆转了胆汁淤积性瘙痒中脊髓活性氧（ROS）以及氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚情况（图8A - E）。在胆管结扎干预后第14天，小鼠表现出脊髓中抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）活性、β - 连环蛋白去乙酰化以及SIRT1表达和活性受到抑制的情况，而预先给予氢气可提升这些指标（图8F - K）。

图7. 吸入氢气可减轻胆汁淤积性瘙痒。

(A) 在胆管结扎（BDL）诱导的胆汁淤积性瘙痒小鼠模型中测试氢气止痒效果的实验设计。该图由BioRender软件绘制。

(B) 在假手术和胆管结扎手术后测量血清总胆红素水平。每组n = 5只小鼠。

(C) 胆管结扎手术后14天黄疸的图像。

(C和D) 苏木精 - 伊红（H&E）染色显示胆管结扎手术后肝脏切片中小胆管纤维化（→）、扩张和新生（▲）以及肝细胞肿胀（黑圈）的情况。比例尺为20μm。

(E) 吸入氢气预处理可抑制胆汁淤积诱导的搔抓行为产生。每组n = 8只小鼠。

(F) 在胆管结扎手术后第21天吸入氢气1小时可减轻已存在的持续性瘙痒。每组n = 8只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验（B）、双向方差分析及邦费罗尼事后检验（E）以及非配对双侧t检验（F）进行分析。

图8. 吸入氢气可减轻胆汁淤积性瘙痒小鼠脊髓背角中依赖SIRT1的β - 连环蛋白乙酰化及氧化应激。

在胆管结扎手术后的第11至13天，每天重复吸入2%的氢气1小时。在胆管结扎干预14天后收集脊髓组织用于生化实验。

(A和B) 二氢乙啶（DHE）染色检测到氢气可减少脊髓活性氧的生成。比例尺为50μm。

(C - E) 酶联免疫吸附测定（ELISA）显示氢气可减少脊髓氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的积聚。

(F - H) 氢气逆转了脊髓背角中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低。

(I和J) 蛋白免疫印迹法显示，吸入氢气可增加胆管结扎手术后SIRT1的表达并降低β - 连环蛋白乙酰化。

(K) 胆管结扎手术后SIRT1活性的降低可通过吸入氢气得到逆转。每组n = 5只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验（B - H、J和K）进行分析。

2.7. 脊髓中SIRT1受到抑制会消除氢气在慢性瘙痒状况下的止痒和抗氧化作用

然后，为了评估SIRT1级联反应在氢气疗法及瘙痒表型中的潜在作用，在不同慢性瘙痒小鼠模型中，在吸入氢气后立即鞘内注射选择性SIRT1抑制剂（EX527）。生化实验检测到，EX527（10μg而非1μg）可有效下调氢气治疗后皮炎（图9A - D）、糖尿病（图9E - H）和胆汁淤积（图9I - L）小鼠脊髓背角中SIRT1及抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）增强的活性，这意味着EX527足以抑制SIRT1活性及抗氧化作用。同时，EX527（10μg而非1μg）显著抑制了氢气治疗后皮炎（图S4）、糖尿病（图S5）和胆汁淤积（图S6）所致氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）的减少。此外，我们还观察到EX527（10μg而非1μg）以剂量依赖的方式消除了氢气气体对皮炎诱导瘙痒（图9M）、糖尿病瘙痒（图9N）和胆汁淤积瘙痒（图9O）的治疗效果。这些数据都表明，依赖SIRT1的抗氧化反应是氢气疗法减轻持续性瘙痒的一个重要环节。

图9. 在慢性瘙痒状况下，脊髓中对SIRT1的抑制会削弱氢气的止痒和抗氧化效果。

在不同慢性瘙痒小鼠模型中，在吸入2%氢气后立即鞘内注射选择性SIRT1抑制剂（EX527）。

(A - L) EX527（10μg）足以降低氢气疗法使皮炎（A - D）、糖尿病（E - H）和胆汁淤积（I - L）小鼠脊髓背角中SIRT1、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶升高的活性。每组n = 5只小鼠。

(M - O) EX527（10μg）抵消了氢气疗法对二硝基氟苯（DNFB）诱导瘙痒（M）、链脲佐菌素（STZ）诱导瘙痒（N）和胆管结扎（BDL）诱导瘙痒（O）这三种小鼠模型瘙痒的缓解作用。每组n = 8只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验进行分析。

2.8. 通过药理学抑制β-连环蛋白信号通路可减轻皮炎、糖尿病和胆汁淤积后的慢性瘙痒，其机制是减轻脊髓瘙痒致敏作用

接下来，我们检验了β - 连环蛋白在慢性瘙痒状态下对中枢瘙痒致敏的直接作用。为了探究这一点，我们使用了β - 连环蛋白抑制剂XAV939（鞘内注射，10μg）和iCRT14（鞘内注射，10μg）。在此，我们发现XAV939和iCRT14给药均能有效减轻皮炎诱导的持续性瘙痒（F₂,₂₁ = 53.44，P < 0.0001，n = 8，单向方差分析，图10A）、糖尿病瘙痒（F₂,₂₁ = 25.88，P < 0.0001，n = 8，单向方差分析，图10B）以及胆汁淤积瘙痒（F₂,₂₁ = 9.429，P = 0.0012，n = 8，单向方差分析，图10C）。与此同时，XAV939和iCRT14降低了皮炎（图10D）、糖尿病（图10E）和胆汁淤积（图10F）小鼠脊髓中β - 连环蛋白的过度乙酰化情况，这表明XAV939和iCRT14的有益及止痒作用可能是通过抑制β - 连环蛋白乙酰化实现的。此外，脊髓背角中细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化是病理性瘙痒发展过程中中枢瘙痒致敏不可或缺的指标[9, 53, 54, 55]。引人注目的是，β - 连环蛋白抑制剂XAV939降低了皮炎（F₂,₁₂ = 37.5，P < 0.0001，n = 5，单向方差分析，图10G）、糖尿病（F₂,₁₂ = 45.25，P < 0.0001，n = 5，单向方差分析，图10H）和胆汁淤积（F₂,₁₂ = 28.98，P < 0.0001，n = 5，单向方差分析，图10I）后脊髓中磷酸化ERK的上调情况。此外，β - 连环蛋白抑制剂XAV939使皮炎（图S7）、糖尿病（图S8）和胆汁淤积（图S9）后抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）的活性显著增加。因此，这些结果意味着通过药理学阻断β - 连环蛋白乙酰化，可通过脊髓对细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化及氧化应激的调控来预防慢性瘙痒。

图10. β-连环蛋白信号通路抑制剂可减轻皮炎、糖尿病和胆汁淤积后的慢性瘙痒及脊髓细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化。

在三种慢性瘙痒状况的小鼠模型中，鞘内注射β-连环蛋白抑制剂XAV939（10μg）和iCRT14（10μg）。

(A - C) XAV939和iCRT14均可减轻已有的二硝基氟苯（DNFB）诱导的瘙痒（A）、链脲佐菌素（STZ）诱导的瘙痒（B）以及胆管结扎（BDL）诱导的瘙痒（C）。每组n = 8只小鼠。

(D - F) 蛋白免疫印迹法显示，XAV939和iCRT14均可降低皮炎（D）、糖尿病（E）和胆汁淤积（F）后β-连环蛋白的乙酰化情况。每组n = 5只小鼠。

(G - I) 蛋白免疫印迹法显示，XAV939可抑制皮炎（G）、糖尿病（H）和胆汁淤积（I）后脊髓中细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化情况。每组n = 5只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验进行分析。

2.9. 氢气抑制慢性瘙痒小鼠脊髓背角树突棘形态发生及突触功能可塑性

鉴于脊髓突触可塑性在慢性瘙痒状况中的关键作用[17, 18, 19, 53]，我们测试了氢气是否能够调节脊髓瘙痒感觉中的兴奋性突触传递。首先，在局部应用二硝基氟苯后第3天，颈髓切片Ⅱ层神经元的自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率升高了（P = 0.0071，图11A - C），但其幅度并未改变。同样地，在胆管结扎手术后第14天，胆汁淤积可使腰髓切片Ⅱ层神经元的自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）频率增加（P = 0.0014，图11D - F）。而且，吸入氢气可抑制由皮炎和胆汁淤积所导致的自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）频率升高（P = 0.0244和P = 0.0127，图11A - F），这表明氢气疗法可抑制慢性瘙痒中的突触功能可塑性。

图11. 氢气预处理可抑制慢性瘙痒中的突触可塑性。

在二硝基氟苯应用后的第0至2天、链脲佐菌素注射后的第7至9天以及胆管结扎手术后的第11至13天，分别每天重复吸入2%的氢气1小时。

(A) 三组小鼠在二硝基氟苯干预后第3天脊髓切片Ⅱ层外层神经元的自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）轨迹图。

(B) 展示了二硝基氟苯暴露及氢气处理后自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率，(C) 展示了其幅度。

(D) 三组小鼠在胆管结扎手术后第14天脊髓切片Ⅱ层外层神经元的自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）轨迹图。

(E) 展示了胆管结扎手术后及氢气处理后自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率，(F) 展示了其幅度。

(G - I) 具有代表性的显微照片分别展示了在二硝基氟苯应用后第3天、链脲佐菌素注射后第10天以及胆管结扎手术后第14天脊髓背角的树突棘形态。比例尺 = 5μm。对树突棘密度进行了评估。每组n = 5只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验进行分析。

近期文献强调了树突棘形态发生在中枢敏化及疼痛传导中的感觉突触功能可塑性方面的独特作用[56, 57, 58]。然而，树突棘形态发生是否参与慢性瘙痒仍不清楚。我们通过高尔基染色获得的生化结果检测到，在皮炎（图11G）、糖尿病（图11H）和胆汁淤积（图11I）后树突棘密度显著增加。更重要的是，吸入氢气抑制了皮炎性瘙痒（F₂,₁₂ = 19.01，P = 0.0002，单向方差分析，图11G）、糖尿病性瘙痒（F₂,₁₂ = 43.00，P < 0.0001，单向方差分析，图11H）和胆汁淤积性瘙痒（F₂,₁₂ = 29.96，P < 0.0001，单向方差分析，图11I）小鼠中树突棘数量的增加，这表明氢气可破坏树突棘的结构可塑性。总体而言，这些研究结果都意味着氢气可能通过降低脊髓背角突触（结构和功能）可塑性来控制慢性瘙痒。

2.10. 富氢盐水对皮炎、糖尿病和胆汁淤积后的慢性瘙痒具有保护作用

富氢溶液近期在多项临床试验中已展现出安全性和积极疗效[33]。由于吸入氢气的不便之处限制了其在临床转化方面的意义，我们也研究了富氢盐水（HRS）在慢性瘙痒中是否具有类似治疗效果的可能性（图12）。在二硝基氟苯干预、链脲佐菌素注射以及胆管结扎手术后的早期阶段，分别给小鼠每天腹腔注射三次富氢盐水（5毫升/千克）。正如预期的那样，富氢盐水模拟了吸入氢气的止痒特性，减少了皮炎诱导瘙痒（F₁,₇₀ = 22.85，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图12A和B）、糖尿病瘙痒（F₁,₇₀ = 18.74，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图12C和D）以及胆汁淤积瘙痒（F₁,₇₀ = 44.03，P < 0.0001，n = 8，双向方差分析，图12E和F）中的搔抓活动。同样地，单次腹腔注射富氢盐水（5毫升/千克）进行后处理可显著改善由不同病因（包括皮炎、糖尿病和胆汁淤积）所导致的已形成的瘙痒（图12G - I）。

图12. 富氢盐水可减少小鼠慢性瘙痒的产生和持续。

(A、C和E) 在二硝基氟苯诱导瘙痒（A）、链脲佐菌素诱导瘙痒（C）和胆管结扎诱导瘙痒（E）这三种小鼠模型中，腹腔注射（i.p.）富氢盐水（HRS，5毫升/千克）进行预处理的实验设计。

(B、D和F) 预先给予富氢盐水可预防皮炎诱导的搔抓行为（B）、糖尿病诱导的搔抓行为（D）和胆汁淤积诱导的搔抓行为（F）。

(G - I) 单次腹腔注射富氢盐水（5毫升/千克）可分别减轻皮炎（G）、糖尿病（H）和胆汁淤积（I）后已存在的持续性瘙痒。每组n = 8只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过双向方差分析及邦费罗尼事后检验（B、D和F）以及非配对双侧t检验（G - I）进行分析。

2.11. 氢气可削弱胆汁淤积性瘙痒中感兴趣区域之间大脑功能连接性的变化

基于功能磁共振成像（fMRI）的神经影像学是一种非常有用的无创方法，可用于确定人脑在生理和病理状况下如何发挥功能[59]。人们越来越有兴趣将这种方法应用于基础动物研究，通过在体检测全脑活动及功能连接性（FC）来深入了解皮炎诱导瘙痒的发生机制[54]。此外，功能磁共振成像（fMRI）对于评估给药后的治疗潜力至关重要，它可以提高中枢神经系统相关研究中药物研发的成功率[60]。在此，我们利用静息态功能磁共振成像（fMRI）来评估胆汁淤积性瘙痒模型中的大脑活动以及对氢气疗法的反应（图13）。有趣的是，我们首先发现胆管结扎手术后14天，右侧初级扣带回皮质（RPCC）的低频波动幅度（ALFF）显著增加，而吸入氢气可抑制这种增加（F₂,₁₈ = 24.33，P < 0.0001，n = 7，单向方差分析，图13A和B）。对于功能连接性（FC）分析，我们将种子区域定义为在三组中低频波动幅度（ALFF）出现显著变化的右侧初级扣带回皮质（RPCC）区域簇。引人注目的是，我们检测到在胆汁淤积性瘙痒小鼠中右侧初级扣带回皮质（RPCC）与双侧感觉运动皮质之间的功能连接性增强，而氢气疗法可降低这种增强（图13C和D）。同样地，我们还观察到胆管结扎手术后右侧初级扣带回皮质（RPCC）与双侧纹状体之间的大脑功能连接性增加，而吸入氢气可极大地阻止这些功能网络变化（图13C和D）。

图13. 氢气可阻止小鼠胆汁淤积性瘙痒中大脑功能连接性的变化。

在胆管结扎手术后的第11至13天，每天重复吸入2%的氢气1小时。在胆管结扎手术后第14天利用静息态功能磁共振成像（fMRI）来评估大脑活动以及对氢气疗法的反应。

(A和B) 功能磁共振成像（fMRI）展示了三组小鼠右侧初级扣带回皮质（RPCC）低频波动幅度（ALFF）的差异。

(C和D) 在胆管结扎手术后第14天，对三组小鼠右侧初级扣带回皮质（RPCC）与感兴趣区域（感觉运动皮质和纹状体）之间功能连接性（FC）的差异进行了检测。图A和C中的颜色条表示F值。每组n = 7只小鼠。数据以平均值±标准差表示，并通过单向方差分析及邦费罗尼事后检验进行分析。

3. 讨论

慢性瘙痒背后尚未明确的机制阻碍了止痒疗法的进展[9, 10, 14, 20]。在本次研究中，对三种小鼠模型（皮炎、糖尿病和胆汁淤积）的初步特征描述重现了慢性瘙痒行为的发展过程，同时伴随着脊髓背角神经元中SIRT1表达及活性下降、β-连环蛋白乙酰化增加，以及中枢瘙痒致敏的标志性特征出现，包括细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化、树突棘形态改变以及自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）频率增加。本研究的核心发现是，氢气疗法通过脊髓背角的SIRT1 - β-连环蛋白轴抑制氧化损伤和突触可塑性，从而对慢性瘙痒起到保护作用（图14）。总体而言，我们的研究结果揭示了氢气在治疗不同病因所致瘙痒方面此前未被认识到的优势。

图14. 所提出的氢气在小鼠慢性瘙痒中的止痒机制示意图。

在皮炎、糖尿病和胆汁淤积发生后，来自瘙痒初级传入神经中枢末梢释放的特异性神经肽会导致脊髓背角突触后神经元兴奋性过高，抑制神经元中SIRT1的表达及活性。失活的SIRT1会促进β-连环蛋白过度乙酰化，进而驱动细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化、活性氧（ROS）积聚以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶）活性降低。这些情况可能会加重神经元氧化应激，促进树突棘形态发生以及兴奋性突触传递，所有这些都有助于皮炎诱导瘙痒、糖尿病瘙痒和胆汁淤积瘙痒的发展。更重要的是，氢气气体通过增强依赖SIRT1的β-连环蛋白去乙酰化作用来减轻氧化应激、脊髓瘙痒致敏以及突触可塑性，从而实现止痒效果。该图由BioRender软件绘制。

氧化应激过程中的蛋白质翻译后修饰是脊髓背角兴奋性神经毒性和突触可塑性的一个基本过程，这进一步涉及到中枢敏化介导的躯体感觉模式（疼痛和瘙痒）[20, 21, 22, 23, 36]。SIRT1对β-连环蛋白的去乙酰化作用逐渐被认为是与氧化相关的神经系统疾病（如缺血性脑卒中[61]、锰诱导的发育性神经毒性[46]、脊髓损伤[62]）的治疗靶点。然而，关于SIRT1、β-连环蛋白与瘙痒脊髓神经回路中的氧化作用之间的联系，人们知之甚少。在我们目前的研究中，最有趣的发现之一是β-连环蛋白级联反应是SIRT1激活以控制慢性瘙痒的一个重要下游效应器。具体而言，在患有皮炎、糖尿病和胆汁淤积的小鼠中，脊髓背角神经元中SIRT1表达及活性的降低与β-连环蛋白的过度乙酰化高度相关。腹腔注射SIRT1激活剂可有效预防皮炎诱导的慢性瘙痒。此外，我们首次证明了鞘内（而非皮内）使用SIRT1激活剂治疗可重现全身使用SIRT1激活剂治疗的所有止痒效果。同时，SIRT1激动作用可减少脊髓中β-连环蛋白乙酰化、活性氧生成、氧化产物（丙二醛、8 - 羟基脱氧鸟苷和3 - 硝基酪氨酸）积聚以及在皮炎诱导的慢性瘙痒中的线粒体损伤。另外，SIRT1激活可增加皮炎小鼠脊髓背角中抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）的活性。最后，本研究首次发现β-连环蛋白抑制剂可减轻皮炎、糖尿病和胆汁淤积后脊髓背角中的慢性瘙痒表型、β-连环蛋白乙酰化、细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化以及神经元氧化应激。从机制上讲，我们研究中的所有这些发现与先前关于SIRT1和β-连环蛋白在不同病因所致慢性疼痛发病机制中作用的报道一致[41, 42, 63]，这进一步证实了疼痛和瘙痒具有一些相似的神经回路。我们的研究结果也从分子角度为氧化损伤对慢性瘙痒的神经调节作用提供了新的见解。虽然我们的结果有力地表明，SIRT1激活可能是一种通过阻断β-连环蛋白乙酰化来调节持续性瘙痒状态的有用策略，但仍有必要进一步研究以确定瘙痒中这些分子改变、行为模式以及神经回路功能失调背后的确切机制。

氢气在实验和临床试验中已被充分证实是安全的，且几乎没有副作用[32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40]。此外，我们之前的研究证实，在小鼠中吸入2%的氢气1小时是安全的，并且对肺组织学变化和氧合指数没有影响[64, 65]。氢气是一种选择性抗氧化剂，它比其他活性氧清除剂（如维生素E和超氧化物歧化酶）能更有效地清除细胞毒性氧自由基[32]。吸入氢气、注射富氢盐水、饮用富氢水以及通过滴眼液扩散直接摄入氢气是吸收或利用氢气的主要方法[33]。李等人近期的一篇文献证实，在足底切口手术小鼠模型中，富氢盐水通过清除活性氧减轻了术后疼痛[38]。另一篇报道显示，在慢性缩窄性损伤大鼠模型中，富氢盐水通过抑制髓过氧化物酶、蛋白质羰基和丙二醛的表达减轻了机械性异常性疼痛[66]。与此一致的是，我们之前的研究强调，富氢盐水通过抑制脊髓过氧亚硝酸盐生成和锰超氧化物歧化酶的硝化作用，减轻了瑞芬太尼诱导的术后痛觉过敏[36, 37]。在此，我们提供了几条证据来强调氢气疗法在多种病因所致慢性瘙痒中的治疗效果及其潜在靶点。首先，吸入氢气和注射富氢盐水都足以预防和减轻皮炎诱导的慢性瘙痒、糖尿病瘙痒和胆汁淤积瘙痒。其次，在患有慢性瘙痒的小鼠脊髓背角中，氢气暴露可上调SIRT1的表达及活性，下调β-连环蛋白的乙酰化，增强抗氧化酶的活性，并减少活性氧和氧化产物的生成。第三，氢气处理可降低体外皮炎和胆汁淤积诱导的脊髓自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）频率的增加。第四，氢气可减轻皮炎、糖尿病和胆汁淤积后慢性瘙痒中脊髓树突棘的产生。第五，在胆汁淤积模型中，氢气可削弱右侧初级扣带回皮质与双侧感觉运动皮质/纹状体之间大脑功能连接性的增强。第六，脊髓中对SIRT1的抑制会削弱并消除氢气的止痒和抗氧化特性。综上所述，这些行为学、生化学和电生理学的研究结果首次表明，氢气通过增加依赖脊髓SIRT1的β-连环蛋白去乙酰化作用来抑制氧化损伤、树突棘形态发生以及突触可塑性，从而预防慢性瘙痒的产生和持续（图14）。支持这些数据的是，氢气处理对SIRT1活性的增强作用最近已在多个病理过程中得到重现[32, 49, 50]。然而，我们尚未阐明氢气是如何增加瘙痒反应性神经元中脊髓SIRT1的表达及活性的。实际上，据报道，DNA甲基转移酶（DNMTs）和转录因子P53是调节SIRT1表达的重要表观遗传调节因子[25, 67]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）比值以及翻译后修饰（如泛素化、磷酸化和S - 亚硝基化）对SIRT1活性的调节至关重要[25, 67]。因此，在进一步的机制研究中探索氢气在慢性瘙痒状况下如何调节脊髓SIRT1级联反应的具体机制将会很有趣。此外，我们之前的报告指出，通过激活干扰素基因刺激因子（STING）和I型干扰素（IFN - I），可通过下调神经炎症依赖的神经元兴奋性毒性，对吗啡诱导的急性瘙痒和皮炎诱导的慢性瘙痒起到强大的抑制控制作用[54]。鉴于氢气在疼痛治疗中具有特殊的抗神经炎症功能[34, 35, 38, 40]，在未来探索干扰素基因刺激因子（STING）依赖的I型干扰素（IFN - I）反应是否是氢气止痒和抗炎的潜在治疗靶点将会很有意义。

脊髓瘙痒编码神经元特征方面的一项进展是发现了脊髓背角中一种关键的瘙痒特异性神经肽——胃泌素释放肽（GRP）与其受体胃泌素释放肽受体（GRPR）之间的相互作用，这种相互作用会激活表达胃泌素释放肽受体（GRPR）的瘙痒感受性神经元，这些神经元负责脊髓对周围瘙痒信息的感知和传导[14, 15, 18, 68]。除了表达胃泌素释放肽受体（GRPR）的兴奋性神经元外，脊髓瘙痒感受性回路的另一个主要组成部分也已被阐明[10, 19, 53]。通过药理学和化学遗传学方法激活表达γ - 氨基丁酸（GABA）的脊髓抑制性神经元可消除急性和慢性瘙痒样搔抓行为，这表明γ - 氨基丁酸（GABA）能中间神经元对瘙痒感受性神经回路具有显著的抑制作用[19, 69]。同样地，通过化学遗传学方法激活表达强啡肽的脊髓抑制性神经元可显著改善致痒原诱发的瘙痒行为，这强调了表达强啡肽的神经元在调控瘙痒感受性信息处理中的关键作用[19, 70]。我们目前的研究显示，SIRT1主要分布于背角神经元，而非星形胶质细胞和小胶质细胞。然而，我们这项工作的一个主要局限在于，无法确定脊髓SIRT1是否表达在表达胃泌素释放肽受体（GRPR）的兴奋性神经元和γ - 氨基丁酸（GABA）能抑制性神经元上，也无法在我们的瘙痒模型中测试SIRT1、胃泌素释放肽受体（GRPR）和γ - 氨基丁酸（GABA）之间的功能相互作用。此外，在背根神经节（DRG）层面，一部分表达Mas相关G蛋白偶联受体A3（MrgprA3）的初级感觉神经元被认为可选择性地将瘙痒信号传递至脊髓，这支持了瘙痒特异性神经元的存在以及止痒疗法的选择性理论[16, 71]。因此，可能需要进行额外的研究来评估背根神经节（DRG）中这些瘙痒特异性神经递质和神经元是否是氢气止痒的潜在靶点。另一个可能的局限是，我们未能研究脊髓氧化损伤如何在慢性瘙痒的发病机制中介导树突棘形态发生和突触可塑性。我们之前强调过，氧化应激会促进神经元铁积聚，从而诱导并维持病理性疼痛中的突触可塑性[37]。鉴于脊髓铁过载对皮炎诱导瘙痒和胆汁淤积瘙痒的影响[72]，神经元铁积聚有可能成为促进与氧化相关的中枢瘙痒致敏在慢性瘙痒发展过程中的关键因素。最后，这些积极的研究结果可能并不适用于异位性瘙痒（机械性瘙痒）[19, 53, 54]和淋巴瘤诱导的神经性瘙痒[17, 53]，这有待未来前瞻性研究进一步探讨。

4. 结论

总之，通过利用三种经过验证的慢性瘙痒小鼠模型，这项临床前研究强调了氢气通过靶向SIRT1 - β - 连环蛋白通路调节脊髓氧化应激和突触可塑性以及后续的大脑功能连接性来减轻瘙痒这一尚未被探索的药理学特性。因此，氢气疗法、SIRT1激活以及β - 连环蛋白抑制可能是缓解不同病因所致瘙痒的有前景的选择。

5. 实验部分

动物：8 - 10周龄的成年雄性和雌性C57BL/6J小鼠饲养在人工控制的12小时明暗循环环境中，可自由获取食物和水。每只动物均购自中国军事医学科学院实验动物中心。经天津医科大学总医院动物伦理与福利委员会（中国天津）批准，所有实验研究及方案均严格按照美国国立卫生研究院《实验动物的饲养与使用指南》执行。行为学数据由对处理情况不知情的研究人员收集。在进行任何基线测试之前，动物至少需经过两天的日常适应期以适应测试条件。在整个试验过程中，室温及湿度保持恒定。

药物及给药方式：1 - 氟 - 2,4 - 二硝基苯（DNFB；货号D1529）和链脲佐菌素（STZ；货号572201）购自西格玛奥德里奇（美国密苏里州圣路易斯市）。特异性SIRT1激动剂SRT1720（货号ab273598）和选择性SIRT1抑制剂EX527（ab141506）购自艾博抗（英国剑桥市）。β - 连环蛋白抑制剂XAV939（HY15147）和iCRT14（HY16665）购自美迪西（美国新泽西州蒙茅斯章克申市）。鞘内注射是指使用30号针头在L4和L5椎间隙穿刺脊髓，将药物（5μl）注入脑脊液中[54, 58, 72]。

氢气疗法：

对于氢气吸入，将动物放置在一个带有进气口和出气口的密封有机玻璃箱内。使用TF - 1气体流量计（日本尤塔卡工程公司，东京）以4升/分钟的流速将氢气引入箱内空气中。箱内氧气供应并保持在21%，使用气体分析仪（医用气体分析仪LB - 2，型号40M；美国贝克曼库尔特公司，富勒顿市）持续监测氧气含量。使用HY - ALERTA手持式探测器500型（美国H2Scan公司，巴伦西亚市）持续监测箱内氢气含量，并在整个治疗过程中使其保持在2%。使用巴拉林（Baralyme）从箱内去除二氧化碳。未接受氢气治疗的动物放置在同一箱内，以4升/分钟的流速通入空气。本研究中氢气吸入的浓度和时长是根据先前的报道[34, 48, 64, 65]以及我们的初步研究选定的。

富氢盐水的制备过程参照我们之前的报道[36, 37, 40]。简要来说，使用富氢水生成系统（日本尤塔卡工程公司，东京），在高压（0.4兆帕）下将氢气溶解于生理盐水中6小时，直至达到过饱和水平。饱和富氢盐水在常压下4°C保存在铝袋中，经伽马射线消毒，每次使用时新鲜制备以保持浓度始终大于0.6毫摩尔/升。

慢性瘙痒小鼠模型：

皮炎诱导的慢性瘙痒：

按照先前文献记载的方法[72]，通过将1 - 氟 - 2,4 - 二硝基苯（DNFB）涂抹于颈部皮肤来构建过敏性接触性皮炎（ACD）慢性瘙痒模型。具体而言，将1 - 氟 - 2,4 - 二硝基苯（DNFB）用丙酮与橄榄油按4:1的比例溶解。先在小鼠剃毛后的腹部皮肤局部涂抹50μl的0.5% 1 - 氟 - 2,4 - 二硝基苯（DNFB）使其致敏。5天后，在小鼠剃毛后的颈部涂抹30μl的0.25% 1 - 氟 - 2,4 - 二硝基苯（DNFB），并在第2、4、6天重复涂抹。在颈部皮肤涂抹1 - 氟 - 2,4 - 二硝基苯（DNFB）后，分别在第3、5、7、9天监测60分钟内的搔抓冲动行为。搔抓定义为抬起后爪搔抓涂抹部位的颈部，然后放下后爪。由不知情的人员对一小时内的搔抓次数进行盲数统计。

糖尿病诱导的慢性瘙痒：

通过高脂饮食（HFD）喂养和链脲佐菌素（STZ）注射构建2型糖尿病（T2DM）模型[73]。具体操作是，给小鼠喂食高脂饮食（含60%脂肪、20%蛋白质和20%碳水化合物）8周。然后，将链脲佐菌素（65mg/kg，溶解于0.1mol/L柠檬酸缓冲液[pH 4.5]）连续3天腹腔注射。3天后，空腹血糖（FBG，禁食12小时）≥7.8mmol/L或餐后血糖（PBG）≥11.1mmol/L即诊断为糖尿病，继续喂食高脂饮食。对照小鼠给予正常饮食，并注射等体积的溶媒溶液。在链脲佐菌素（STZ）注射后每周测量体重和血糖水平。在2型糖尿病模型建立后，由不知情的人员对一小时内的搔抓次数进行盲数统计。搔抓定义为抬起后爪搔抓身体任何部位，然后放下后爪。