程序性细胞坏死和凋亡不同，细胞坏死释放细胞内物质，能导致炎症反应，这是许多感染和非感染性炎症相关疾病的重要细胞学基础。但是细胞内物质释放的具体细节过去了解并不充分，给有效针对细胞坏死导致的炎症反应的控制带来困难。最近有研究对这个细胞释放细胞内物质的过程提供了更全面的认识，这一认识有望帮助解决这种内源性炎症反应的策略。

The role of NINJ1 protein in programmed cellular destruction (yyttgd.top)

程序性细胞死亡（PCD）是在癌症和发育背景下去除受损或不需要的细胞的中心过程。它在免疫系统的正常运作中也起着关键作用1.在免疫系统防御领域，PCD可以剥夺细菌或病毒的宿主细胞家园，从而阻止感染的传播1.对死亡的控制在生命中是如此重要，以至于PCD至少已经进化出三种复杂的途径 - 分别称为细胞凋亡，焦亡和坏死性凋亡 1。 Degen 2和Kayagaki 等人3阐明蛋白质NINJ1在某些类型PCD的最后阶段如何发挥作用。

PCD和基因编码死亡背后的机制长期以来一直让生物学家着迷。PCD研究最多的形式最初由Karl Vogt在1842年观察和报道，现在称为细胞凋亡，通常“悄悄地”结束，垂死的细胞在被巨噬细胞摄入之前萎缩和破碎，巨噬细胞处理这种垃圾处理。相比之下，焦亡和坏死性凋亡都以爆炸结束 - 围绕细胞的质膜对细胞完整性破裂和细胞内容物泄漏至关重要4.在某些情况下，凋亡细胞可以进展到第二阶段（称为细胞凋亡的继发性坏死），其中垂死的细胞发展出“气泡状”结构，质膜最终破裂1.

如果细胞以这种方式破裂并且其细胞质内容物溢出，则包含在细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH）和大的促炎分子，称为损伤相关分子模式（DAMPs）等蛋白质通常，从细胞中逸出（图1）。细胞外存在DAMPs向免疫系统表明一切都不好，并且会产生持续且有时极其强烈的炎症反应以应对威胁1,4.细胞凋亡中的焦亡、坏死凋亡和血浆膜破裂都可以因病毒或细菌感染而触发，并且都是许多慢性病，包括癌症和神经退行性疾病组织损伤的基础1,4.、

图1 |NINJ1蛋白如何在细胞死亡中起作用。当细胞通过称为焦亡的过程或称为细胞凋亡的某些形式的细胞死亡而死亡时，NINJ1介导质膜破裂。单个（单体）NINJ1蛋白在其氨基（N）和羧基（C）末端之间含有四个称为α1，α2，α3和α4的α螺旋。Kayagaki 等.3报告一种抗体，该抗体阻止NINJ1蛋白在细胞死亡之前的寡聚化过程中组装。Degen等.2提供NINJ1介导细胞死亡时发生的变化的结构数据。在NINJ1被激活之前，α1和α2位于细胞外。随着寡聚化发生，螺旋方向发生变化，α2进入膜，使其相对于α3和α4定位。单个蛋白质之间的接触由α1介导，α1具有独特的角度取向。寡聚NINJ4大孔形成使乳酸脱氢酶（LDH）和DAMPs炎症分子等蛋白质离开细胞。

焦亡的核心是造孔蛋白GSDMD5,6.这些分子通常以可溶性形式存在于细胞质中，但是当在焦亡期间被激活时，它会在质膜中组装形成孔。这些孔非常小（直径约21纳米），但足以让促炎分子逃离垂死的细胞，但太小而不允许释放大的DAMPs和LDH。长期以来，人们认为GSDMD孔通过离子的非选择性通量和渗透应激的诱导来促进细胞破裂的被动过程。然而，这一观点被一项研究推翻了。研究证明等离子膜破裂以及焦亡中LDH和DAMPs的释放需要NINJ1。该研究和Kayagaki 等人的工作表明，NINJ1也是细胞凋亡中血浆膜破裂所必需的，细胞凋亡是在细胞死亡开始后发生的事件，并且与GSDMD无关。

NINJ1是一种小的跨膜蛋白，包括一个细胞外氨基末端区域和两个羧基末端跨膜螺旋。该蛋白质先前被鉴定为神经损伤后产生的粘附分子8.因此，它被鉴定为细胞死亡中膜破裂的关键介质7是一个重大而出乎意料的发现。

NINJ1在膜破裂中的作用以及NINJ1功能背后的分子机制的确切细节尚不完全清楚。Degen及其同事解决了这个问题，并通过使用各种成像技术和生化方法表明，NINJ1可以经历构象重排，导致蛋白质多个拷贝的自缔合（寡聚化）。这种结构穿透膜，形成大的、不规则形状的孔。

Kayagaki 等报告他们开发了一种称为克隆D1的强效抗NINJ1抗体，该抗体可阻断NINJ1寡聚化并防止细胞在焦亡和凋亡的情况下破裂。通过细胞研究和检查与肝炎相关的细胞死亡小鼠模型，Kayagaki及其同事表明，与具有功能性NINJ1的细胞相比，编码NINJ1的基因的遗传缺失或由克隆D1介导的NINJ1抑制减少了血浆膜破裂并减少了LDH和DAMPs的释放。

Degen等人使用交联技术揭示了NINJ1齐聚发生在GSDMD孔形成之后，LDH释放发生在NINJ1低聚物形成之后。产生功能活性的NINJ1荧光形式使作者能够在焦亡期间观察到质膜上的这种蛋白质聚集。在此基础上，Degen等人。使用超分辨率显微镜揭示了NINJ1簇为膜中的长，高度支化的细丝和大的环形结构。值得注意的是，其中一些细丝达到微米长度。

使用尺寸排阻色谱，活细胞成像和负染色电子显微镜的组合，Kayagaki及其同事表明NINJ1寡聚成大细丝，并且这些结构的组装被克隆D1阻断。至关重要的是，克隆D1阻止了NINJ1介导的货物释放，该货物被包裹在脂质（脂质体）中，表明该抗体在模型膜系统中起作用。

Degen及其同事在体外生产NINJ1，并使用洗涤剂提取低聚形式，他们使用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）进行分析。获得的结构达到了接近原子级的分辨率，并揭示了NINJ1灯丝中的基本重复单元包括四个α螺旋结构（图1）。C末端（α3和α4）中的两个疏水跨膜α螺旋堆叠在一起形成灯丝的核心，N末端区域（α2）中的两个螺旋中的一个与α3和α4堆积。两个螺旋中的第二个（α1）与α2呈独特的角度方向，并形成广泛的亚基内接触，连接相邻的NINJ1蛋白。

作者发现，α2、α3和α4的分子排列与使用蛋白质结构预测工具Alphafold生成的模型一致。9.相比之下，不出所料，α1的关键作用以及该螺旋在驱动NINJ1自组装中的分子相互作用并没有被Alphafold预测。这加强了在结构生物学中使用实验方法的必要性，因为预测技术既不能揭示NINJ1的显着功能，也不能揭示这种相对较小的蛋白质的机制复杂性。

Degen等.解释 NINJ1 如何破坏膜。一个关键的观察结果是，α1和α2有一个面是疏水的，另一个是亲水的。因此，在NINJ1未寡聚化的活细胞中，有人提出α1和α2在细胞外环境中，而不是在膜中。然而，在细胞死亡过程中，α1和α2插入膜中，从而主要通过α1和α3与来自相邻亚基的α4疏水面之间的相互作用来驱动NINJ1寡聚化。这种结构会破坏膜完整性，并通过将α1和α2的亲水面引入疏水膜而形成病变或孔。Degen等人通过对NINJ1突变体的全面分析和分子建模研究来支持这些机制观点。

克隆D结合的NINJ1区域被Kayagaki及其同事定位为NINJ1的C末端 - 一个在冷冻电镜结构中未捕获的柔性区域。以前，N和C末端已被证明（通过突变研究）不是质膜破裂所必需的7.作者认为，克隆D1通过阻断NINJ1蛋白的自缔合来阻止NINJ1寡聚化。

这两项研究揭示了NINJ1如何在PCD的最后行为中发挥作用，确保细胞膜的完全破坏并从细胞质中释放DAMPs。因此，NINJ1加入了参与PCD的成孔蛋白的拥挤领域。这些分子在细胞凋亡中具有中心和多重作用（如穿孔素的情况）10， 焦亡 （GSDMD）5,6和坏死性凋亡（例如，细菌形成孔隙毒素或 MLKL 蛋白）11,12.

许多问题仍然存在。例如，如何集成和控制不同类型的PCD以实现DAMP的最佳释放？究竟是什么触发了NINJ1诱导的孔隙形成？最后，鉴定出能够抑制NINJ1体内孔形成活性的抗体提出了一个有趣的问题，即NINJ1是否可能代表某些慢性炎症性疾病的治疗靶点。

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