Z-VAD-FMK是一种细胞渗透性的、不可逆的广谱半胱天冬酶抑制剂。它是生物医学研究中用于抑制细胞凋亡的关键工具分子。其名称中的“Z”代表苄氧羰基保护基，“VAD”是缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸的三肽序列，“FMK”代表氟甲基酮，是其发挥不可逆抑制作用的关键活性基团。
化学性质
化学名称： N-苄氧羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮
别名： Z-VAD(OMe)-FMK; Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK; 泛Caspase抑制剂
分子式： C₂₂H₃₀FN₃O₇
分子量： 467.49 g/mol
外观： 通常为白色至类白色粉末。
纯度：99%
厂商：AbMole
溶解性： 在水溶液中溶解度极低。需先溶于极性有机溶剂（如二甲基亚砜，DMSO）中配制成高浓度的储存液（例如，20-100 mM），使用时再稀释到培养液或缓冲液中。DMSO储存液应置于-20°C或更低温度保存。
稳定性： 固体粉末在干燥、低温条件下稳定。DMSO储存液应避免反复冻融，并需严格避光保存，以维持其活性。在水溶液或细胞培养液中稳定性相对较差，会随时间推移而降解。
化学结构特点： 其结构模拟了Caspase酶天然底物的识别序列（在Asp之后切割），并以反应活性极高的氟甲基酮基团作为“战争头”，与Caspase酶的活性中心半胱氨酸共价结合。
作用原理与机制
识别与结合： 分子中的三肽序列“Val-Ala-Asp”模拟了Caspase多种底物（如caspase-3, 7, 8等）的保守识别序列。这使得Z-VAD-FMK能够进入Caspase酶的活性中心，并与特定的氨基酸残基通过氢键、范德华力等相互作用进行结合。
共价修饰与失活： 一旦结合，分子末端的氟甲基酮基团会与Caspase活性中心的催化性半胱氨酸残基的巯基发生亲核取代反应。这个反应导致一个不可逆的共价键形成，在酶的活性中心生成一个稳定的硫醚加合物。
酶活性的丧失： 由于活性中心的半胱氨酸被共价“封锁”，Caspase酶失去了催化切割其天然底物的能力，从而被永久性失活。这种不可逆的抑制使得Z-VAD-FMK能够有效地阻断凋亡信号的下传。
细胞凋亡主要有两条通路：外源性（死亡受体）通路和内源性（线粒体）通路。这两条通路最终都会汇聚到激活一系列Caspase酶，即起始Caspase（如caspase-8, -9, -10）和效应Caspase（如caspase-3, -6, -7）。Z-VAD-FMK作为一种广谱抑制剂，能够同时抑制这两条通路下游的绝大多数Caspase，从而阻止细胞的凋亡进程。
实验与应用
在科学研究中的应用
Z-VAD-FMK是研究细胞死亡，特别是细胞凋亡的核心工具。
鉴定细胞死亡方式： 当观察到细胞死亡时，研究人员会使用Z-VAD-FMK进行处理。如果细胞死亡被显著抑制，则表明该过程是Caspase依赖性的凋亡。如果死亡未被抑制，则提示可能存在Caspase非依赖性的细胞死亡方式，如坏死、焦亡或铁死亡等。
研究凋亡信号通路： 通过在不同时间点或与不同刺激物组合使用Z-VAD-FMK，可以帮助解析凋亡信号通路的上下游关系，以及特定蛋白在通路中的作用。
“挽救”实验： 在建立某种凋亡模型（如药物诱导、基因敲除诱导凋亡）时，使用Z-VAD-FMK可以验证表型是否确实由凋亡引起，即通过抑制Caspase来“挽救”细胞，使其免于死亡。
注意事项与局限性
非特异性： 尽管Z-VAD-FMK主要靶向Caspase，但在较高浓度下，它也可能非特异性地抑制其他一些半胱氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶，导致脱靶效应。因此，在实验设计中应使用能够有效抑制凋亡的最低有效浓度（通常在10-100 µM范围内）。
不能完全阻止所有形式的细胞死亡： 它只能抑制Caspase依赖的凋亡。如果细胞死亡主要通过坏死、焦亡或铁死亡等途径进行，Z-VAD-FMK将无法提供保护。
溶剂对照： 由于需要溶解在DMSO中使用，实验中必须设置含有相同浓度DMSO的溶剂对照组，以排除DMSO本身对细胞的潜在毒性影响。
时间窗口： 为了有效抑制凋亡，Z-VAD-FMK通常需要在凋亡刺激之前或同时加入细胞。如果在凋亡执行阶段（如Caspase已被大量激活后）再加入，其保护效果会大打折扣。
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