一、化学性质

• 化学名称： 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯

• 常见别名： DCFH-DA；活性氧(ROS)探针

• 分子式： C₂₄H₁₆Cl₂O₇

• 分子量： 487.29 g/mol

• 外观： 通常为白色或类白色结晶性粉末

• 溶解性： 易溶于DMSO（溶解度高达97 mg/mL），溶于乙醇，在水中的溶解度极低

• 稳定性： 对光、空气敏感。建议在-20°C、避光、干燥条件下保存，并避免反复冻融

• 荧光特性： 氧化产物的最大激发/发射波长约为 492-495/517-527 nm，部分来源提及激发波长可至 511 nm，发射至 533 nm 。

二、原理机制

H2DCFDA是一种用于检测细胞内活性氧（ROS）的荧光探针。其本身不具有荧光性，作为一种前体探针，其工作原理基于其在细胞内的转化过程。首先，由于它具有细胞膜渗透性，可以轻易进入活细胞内部。进入细胞后，细胞质内的酯酶会将其乙酸酯基团水解切去，生成不易透出细胞的二氯二氢荧光素（H2DCF）。此时的H2DCF仍然是非荧光的。

当细胞内部存在活性氧（如H₂O₂、羟基自由基、过氧亚硝酸盐等）时，H2DCF会被这些氧化物氧化，脱氢生成具有强绿色荧光的产物——2',7'-二氯荧光素（DCF）。荧光的强度与细胞内活性氧的水平成正比，因此通过检测荧光信号的强弱，就可以间接反映细胞内的氧化应激水平 。检测时，通常使用流式细胞仪、荧光显微镜或荧光微孔板读数器等设备 。

三、实验应用

H2DCFDA在生物医学研究领域有广泛的应用，主要用于检测和定量细胞内的活性氧水平。

1. 氧化应激检测：这是其最核心的应用。研究人员利用它来评估各种刺激（如化学毒素、辐射、炎症因子等）对细胞造成的氧化应激水平 。

2. 药物作用机制研究：在药物开发中，可用于评估候选药物是否能诱导癌细胞产生ROS以促进凋亡，或者相反，考察药物是否通过抗氧化作用来保护细胞免受损伤 。

3. 环境与毒理学研究：用于检测纳米材料、环境污染物等外界刺激对细胞ROS生成的诱导效应，评估其生物安全性 。例如，有国家标准方法使用其衍生物CM-H2DCFDA来检测纳米颗粒诱导巨噬细胞产生的活性氧 。

4. 信号转导研究：活性氧在细胞增殖、凋亡、炎症反应等多种信号通路中作为关键信使分子，该探针可用于追踪相关信号通路的变化 。

5. 血管生物学研究：有研究利用H2DCFDA作为H₂O₂指示剂，检测血管内皮生长因子（VEGF）刺激血管内皮细胞产生的H₂O₂，并探讨其在促进细胞增殖中的作用 。

四、注意事项

在使用H2DCFDA进行实验时，有几个关键点需要特别注意，以确保实验结果的可靠性：

探针配制与储存：务必使用新鲜配制的工作液。建议将高浓度储备液（通常溶于DMSO）分装后于-20°C避光保存，并尽量避免反复冻融，因为探针在溶液状态下会逐渐氧化，导致本底荧光增高 。

实验条件优化：对于不同的细胞类型和实验目的，需要优化探针的加载浓度（常用起始浓度为1-10 μM）和孵育时间（通常为30分钟） 。加载探针后，建议用预热的缓冲液洗涤细胞，以去除残留的探针。

避免血清干扰：在将染料与细胞共孵育时，不应在培养基中含有血清，因为血清中含有的酯酶可能会在细胞外切割探针，影响其进入细胞 。

控制光照与解读特异性：整个实验过程需要避光操作，以防止荧光淬灭和探针的光氧化。同时，需要了解H2DCFDA对多种活性氧有响应，并非高度特异性的单一ROS指示剂。在解读结果时，应结合实验设计综合考虑 。

设置合理对照：一个完善的实验必须设置包括未处理的阴性对照、ROS阳性诱导对照以及用于评估非ROS依赖性氧化的空白组，这对于正确解读荧光信号的变化至关重要。

五、相关衍生物

为了改善H2DCFDA的某些特性（如在细胞内的滞留能力），研究人员开发了一些衍生物，例如：

CM-H2DCFDA：该衍生物引入了氯甲基基团，使其能够与细胞内的谷胱甘肽等硫醇发生反应，从而更有效地滞留在细胞内，减少了探针的外排，特别适合进行长时间的追踪实验 。

Carboxy-H2DCFDA (如6-羧基-H2DCFDA)：通过在分子上增加羧基基团，增强了探针分子的水溶性和在细胞内的滞留性，使其在检测过程中信号更稳定，不易外泄，有助于提高实验的重复性和稳定性 。

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