2023青年绿碳科学大会于11月11-12日在青岛召开。北京化工大学刘子鹤教授应邀出席，并作了题为“合成生物学助力酵母固碳生物转化”的邀请报告。
合成生物学助力酵母固碳生物转化
研究背景
二氧化碳排放带来全球性气候变化问题，为此世界各国纷纷采取了一系列减排固碳措施。我国于2020年提出“碳达峰 碳中和”发展目标，推进固碳技术发展迫在眉睫。受益于合成生物学领域的迅猛发展，基于微生物细胞工厂的第三代固碳生物炼制，可将二氧化碳等低碳原料固定为一系列化学品和燃料，包括燃料、氨基酸、单细胞蛋白、生物塑料及其他多种生化产品，有望建立以低能耗、低污染、低排放为基础的低碳经济模式。
报告内容
作为真核单细胞模式生物，酿酒酵母具有遗传背景清晰，遗传操作工具成熟等优势，是当前最重要的合成生物学研究底盘细胞之一，被广泛用作生物燃料、精细化学品、植物天然产物等的异源合成宿主。但如何打破酿酒酵母细胞代谢网络的严谨调控，强化其对低碳原料（二氧化碳、甲醇、甲酸等）的生物转化能力，实现目标产品的定向、高效合成与生产，是构建生物固碳微生物细胞工厂面临的主要挑战。针对上述难点问题，需要开发高效遗传改造使能工具，并完成底盘细胞代谢网络的定制化重构。在报告中，刘子鹤教授介绍了基于酿酒酵母宿主的相关工作进展。
高效多靶点基因敲除和点突变工具
CRISPR编辑技术大大提升了底盘细胞改造速度，然而多重基因靶向的应用受限于gRNA加工效率及通量。为此，通过tRNA序列将多个gRNA进行串联表达，开发了gRNA-tRNA-array CRISPR-Cas9（GTR-CRISPR）的系统，能够完成8个基因的同步高效率编辑（阳性率60-80%），为已知酿酒酵母中效率最高和多重基因编辑体系。借助优化质粒构建环节，得到的更为快捷的Lightning GTR-CRISPR系统，能够实现3天内一次性编辑6个基因，效率达到60%。采用该快速系统来优化酿酒酵母脂质代谢网络，在10天内即完成了8个基因的定向精简，所得菌株游离脂肪酸产量提升了约30倍。为了满足底盘代谢优化中多基因单点突变的改造需求，开发了高效基因组点突变工具GTR-CRISPR 2.0，可以同时实现2个不同基因单点突变（每个基因1个点突变），效率达到100%；以及单一基因的4个单点突变，效率为67%。
减碳细胞工厂的构建
对于葡萄糖的利用，在原核与真核生物中存在着显著的进化差异。在原核生物中，糖酵解途径呈现趋异进化（EMP途径, ED途径, PK途径），而真核生物呈现趋同进化（只有EMP途径）。在酿酒酵母中，将糖酵解途径关键酶编码基因PFK1和PFK2敲除后，分别整合来源于原核生物的ED途径和PK途径（磷酸酮糖裂解途径）。结果显示，PK途径可以少量恢复细胞生长，在加入转氢酶之后，比生长速率可以进一步提升。系统生物学分析表明，未知基因OCA5的功能缺失与细胞表型变化密切相关。生化功能实验证实OCA5能够调节5-二磷酸肌醇1,2,3,4,6-五磷酸（5-InsP7）的胞内水平，导致糖酵解途径特异性转录因子Gcl1的下调和呼吸代谢特异性转录因子Hap4的上调，从而减弱糖酵解速率并增强细胞的呼吸代谢。所得到的混合型糖酵解酵母，能够显著提升碳源底物的利用率，摇瓶中游离脂肪酸产量可达2.68 g/L，相比野生型宿主提高了一倍以上，也是现有酿酒酵母中报道的最高水平。
固碳细胞工厂的构建
对于酿酒酵母中葡萄糖和二氧化碳的共同利用，通过整合3-羟基丙酸双循环和SPK途径，可以生产71 g/L平台化合物3-羟基丙酸，为酿酒酵母中的最高水平。此外，通过系统基因工程改造，实现了CO₂和甲酸盐的高效利用。基于13C标记分析，平台菌株的一碳底物同化效率达到了11.24%。通过持续优化，在葡萄糖喂养条件下，最终菌株的甲酸利用率达到了0.48 g/(L·h)，游离脂肪酸的最终产量达到了10.1 g/L，分别提高了21.8倍和33.7倍，为未来生物燃料的酶促制备奠定了基础。对于通过电化学催化二氧化碳得到的电解液中的甲酸及乙酸等低碳原料，工程酿酒酵母菌株可以分别合成脂肪酸80 mg/L和3-羟基丙酸300 mg/L。
展 望
通过开发高效遗传改造使能工具及底盘细胞代谢网络的系统改造，酿酒酵母细胞工厂能够用于生产具备低碳属性的生物燃料化学品，展现出重要的潜力和应用价值。下一步，需要进一步强化底盘细胞对一碳原料的生物转化效率，并有效解决化学催化依赖的底物制备和生物催化依赖的产品合成相偶联的机制，最终实现生物固碳。
专家简介
刘子鹤 教授
刘子鹤，北京化工大学教授，本科和硕士毕业于天津大学化工学院，博士毕业于瑞典查尔姆斯大学。研究方向包括深入探索细胞机制，建立高效的细胞工厂，以及开发系统和合成生物学工具。在过去的五年里，作为第一作者或通讯作者，在Cell、Nature Catalysis、Nature Communication、Green Carbon等高影响力论文期刊上发表学术论文20篇。
原文链接
刘子鹤教授与Green Carbon | 合成生物学助力酵母固碳生物转化
Green Carbon
期刊官网：Green Carbon官网
投稿网址：Green Carbon投稿
公众号：Green Carbon公众号
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