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北京大学第三医院眼科齐虹教授团队在Taylor & Francis系旗下SCI期刊Ocular immunology and inflammation发表优质科研成果“Mapping Resident Immune Cells in the Murine Ocular Surface and Lacrimal Gland by Flow Cytometry”，更新了小鼠眼表组织和泪腺免疫细胞图谱，为眼表免疫领域提供了基石性的数据。此文章在发表后积累了广泛的关注，过去一年约有2000次下载阅读，热度不减。
作者：Baikai Ma, Yifan Zhou, Yuzhe Hu, Hongyu Duan, Zhengze Sun, Pingzhang Wang, Wei Li, Wenling Han, Hong Qi
DOI：10.1080/09273948.2023.2182327
背景
经典的眼表组织包括角膜、角膜缘和结膜。泪腺是泪腺功能单位的中心，通过分泌泪液在眼表稳态和疾病中发挥重要作用。组织驻留免疫细胞在维持眼表免疫稳态和介导与免疫相关的眼部疾病方面具有核心地位。因此，阐明眼表组织和泪腺中的组织驻留免疫细胞是眼表免疫的基石。齐虹教授团队利用流式细胞多色染色技术，选择广泛用于眼表免疫研究的C57小鼠，更新了眼表组织和泪腺免疫细胞图谱。
一、阐明中央角膜与周边角膜的免疫细胞差异
本研究发现周边角膜中定植的免疫细胞数量远多于中央角膜，约16:1（图1）。髓系细胞（CD45+CD11b+或者CD45+CD11c+）是中央和周边角膜主要的免疫细胞。其中，中央角膜仅14.60%的髓系细胞表达MHC II，这表明其抗原递呈能力不足，从而限制了炎症反应并有利于维持角膜的免疫豁免。此外，结合研究者检索文献，本研究通过流式细胞术首次检测到正常小鼠角膜中定植的B细胞。
图1. 小鼠中央与周边角膜免疫细胞数量差异 A. 中央角膜与周边角膜取材分界示意图。B. 中央角膜与周边角膜免疫细胞占单个活细胞比例流式细胞图。
二、提出基于聚类分析的结膜与泪腺髓系细胞新策略
髓系细胞，包括树突状细胞，巨噬细胞，单核细胞和中性粒细胞等，是固有免疫的主要组成部分，且具有较高的异质性。如何更合理地界定髓系细胞是眼表免疫领域备受关注的话题。我们应用tSNE降维和FlowSOM聚类，通过F4/80，Ly6C，Ly6G和MHC II（分别是巨噬细胞，单核细胞，中性粒细胞和树突状细胞的经典marker）的表达，对髓系细胞进行聚类，以识别定植在小鼠结膜和泪腺中的髓系细胞亚群。首先，我们发现许多树突状细胞表达F4/80，由于巨噬细胞也是一种专职抗原提呈细胞，因此这些细胞被界定为巨噬细胞。同时，在前人scRNA-seq的研究中，中性粒细胞占结膜免疫细胞总数的28％[1]；然而我们发现，Ly6G+髓系细胞仅占结膜与泪腺免疫细胞总数的3.52％和0.61％，并且结膜Ly6G+髓系细胞表现为Ly6CintF4/80hi，最终被定义为不成熟的单核细胞，上述结果提示结膜和泪腺稳态下的中性粒细胞含量很低。结膜CD45+CD11b+CD11c-聚类分析见图2。
图2. 结膜CD45+CD11b+CD11c-聚类分析 B. 基于F4/80、Ly6C、Ly6G和MHC II表达量，采用tSNE降维和FlowSOM聚类分析结膜CD45+CD11b+CD11c-细胞群。C. 各细胞亚群F4/80、Ly6C、Ly6G和MHC II的表达水平。D. 细胞亚群组成饼图。
三、系统解析固有淋巴样细胞（ILCs）
ILCs被认为是T细胞在固有免疫中的镜像细胞，但不表达TCR，主要分布于组织中。ILCs在黏膜免疫学领域受到了广泛关注，但是在眼表组织和泪腺的组成和功能尚未得到系统阐明。我们研究显示，结膜和泪腺富含NK细胞和ILC2，ILC3占总ILCs的比例约在3.5%-6%，结膜和泪腺中均未检测到ILC1。本研究首次通过流式细胞术界定结膜和泪腺组织中的ILC3。结膜ILCs分析策略见图3。
图3. 结膜ILCs分析 F. 基于NK1.1、CD127、IFN-γ、IL-5、RORγt和IL-17A表达量，采用tSNE降维和FlowSOM聚类分析结膜CD45+Lineage-细胞群。C. 各细胞亚群NK1.1、CD127、IFN-γ、IL-5、RORγt和IL-17A的表达水平。D. 细胞亚群组成饼图。
四、总结1型和3型免疫细胞
免疫细胞根据产生的标志性细胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-17A）可被分别划分为1、2、3型免疫细胞，利于研究功能相近的免疫细胞。Th1和Tc1细胞在泪腺1型免疫细胞中的比例远高于结膜。相反，结膜中NK细胞的比例远远超过泪腺。3型免疫细胞包括Th17细胞、γδ T17细胞和ILC3等。γδ T17细胞的数量占结膜3型免疫细胞的一半左右，这表明γδ T17细胞可能在眼表组织中具有重要的生理作用，例如伤口愈合和组织修复等。ILC3在结膜中的含量也多于Th17细胞，可能在眼表感染中发挥重要作用。结膜1型和3型免疫细胞组成见图4。
图4. 结膜1型和3型免疫细胞组成 左. 结膜1型免疫细胞亚群组成饼图。右. 结膜3型免疫细胞亚群组成饼图。
总结
本研究采用流式细胞术更新了小鼠眼表组织和泪腺免疫细胞图谱，并与既往人和小鼠单细胞测序结果做了相关比对，以期为眼表免疫领域提供基石性的参考数据。
参考文献
[1] Alam J, Yazdanpanah G, Ratnapriya R, Borcherding N, De Paiva C S, Li D, Pflugfelder S C. Single-cell transcriptional profiling of murine conjunctival immune cells reveals distinct populations expressing homeostatic and regulatory genes[J]. Mucosal Immunol, 2022.
作者团队
本文依托北京大学第三医院眼科、北京大学眼科中心、眼部神经损伤的重建保护与康复北京市重点实验室。博士后马佰凯、博士生周一凡、博士生胡玉喆（北医免疫系）为共同第一作者，齐虹教授和韩文玲教授（北医免疫系）为共同通讯作者。研究得到厦门大学眼科研究所李炜教授、BD产品专员游莉芳、清华免疫所付榴辉博士支持与指导。
齐虹
三级教授，主任医师，博士研究生/博士后导师，眼部神经损伤的重建保护与康复北京市重点实验室PI，北京大学医学部医学技术研究院学术委员会委员。
专业特长：眼表疾病及眼前节屈光重建。研究方向：干眼的免疫学特性及其神经调控机制，老视及高度近视的精准矫正与视觉质量；中医治疗眼表疾病的疗效评价与成果转化，糖尿病相关眼表疾病的多模态评估与诊疗；人工智能眼部影像。
制定国家职业性放射性白内障（2014年）及职业性眼病（2010年）的诊断标准。主持国家自然科学基金面上项目4项，省部级基金2项。在多个国际高质量同行评议杂志上发表论文83篇。授权专利5项。主编/参编眼科教材及专著11部。参与制定眼科领域国际、国内指南或专家共识共8项。
现任中华医学会眼科学分会防盲及流行病学组委员，亚洲干眼学会委员，中国女医师协会眼科专业委员会委员，中国医师协会眼科医师分会眼表与干眼学组委员，中国医药教育协会智能医学专业委员会智能眼科学组常务委员，中国医师协会中西医结合医师分会眼科专业委员会常务委员，并在其他多个学术组织任职。
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