科学网-Phenomics | 复旦大学王瑞团队发布超快速核酸检测技术，可10分钟锁定三种病原体-丁琛的博文

Phenomics | 复旦大学王瑞团队发布超快速核酸检测技术，可10分钟锁定三种病原体

2025-4-7 12:32

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近日，《表型组学（英文）》(Phenomics)在线发表了复旦大学人类表型组研究院王瑞青年副研究员团队联合福州大学张芳副教授团队做的题为“MVPCR: Multiplex visual detection strategy based on ultrafast PCR for point-of-care pathogens detection within 10 min”的研究论文。

该研究开发了一种基于超快速PCR的多重可视化病原检测方法，能够在10分钟内同时检测多种病原体，在现场即时检测领域显示出巨大潜力。

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论文DOI链接：

https://doi.org/10.1007/s43657-024-00216-3

论文引用格式：

Zhang, Z., Wu, C., Bai, L. et al. MVPCR: Multiplex Visual Detection Strategy Based on Ultrafast PCR for Point-of-Care Pathogens Detection Within 10 Min. Phenomics (2025). https://doi.org/10.1007/s43657-024-00216-3

研究背景

病原体的有效检测对生物安全和公共健康至关重要，尤其在食品安全、环境监测和临床诊断等领域。当前，病原体检测方法主要包括细菌培养、免疫检测和分子生物学方法。细菌培养法耗时长且操作繁琐，无法满足快速检测的需求；免疫检测方法受限于抗体的开发和批次间差异；分子生物学方法，尤其是PCR，凭借其高灵敏度和特异性，在病原体检测中得到了广泛应用。然而，传统PCR方法通常需要较长的时间（通常超过一小时），且依赖于昂贵复杂的设备，限制了其在现场和资源有限环境中的应用。

此外，现有的一些可视化检测技术多数依赖于对扩增副产物的检测，如氢离子、镁离子和焦磷酸盐，或使用荧光染料识别双链结构。这些方法没有靶向扩增子本身，特异性较差，容易出现交叉干扰，无法在单一反应中同时实现多种病原体的检测。因此，在该研究中，作者通过结合超快速PCR和不同荧光标记的分子信标（MVPCR），实现了三种病原体的同时检测，并通过自制墨盒实现了可视化结果的输出。

研究结果

首先验证了沙门氏菌（Sa）、副溶血性弧菌（VP）和传染性皮下与造血器官坏死病毒（IHHNV）引物的可行性，结果显示三对引物均能产生良好的扩增曲线，并在凝胶电泳中得到预期的单一条带（图1a）。通过调整变性时间（1-3 s）和退火时间（1-7 s），确定变性时间2 s、退火时间5 s为最优反应时间(图1b)。在已优化的快速循环条件下进行三重扩增实验，结果显示能够成功实现三重扩增，且每条条带的位置与单一目标扩增条带的位置一致(图1c)。以上结果充分证明了在超快速扩增条件下，多重检测具有可行性。

图1 使用超快速PCR进行多重检测的可行性验证

然后探讨了分子信标在三重扩增体系中的可行性，结果表明FAM、HEX和TEX信标均能成功与扩增产物特异性结合并发出相应的荧光信号（图2a）。为减少对专业仪器的依赖，设计了一种便携式3D打印墨盒，能够通过肉眼有效识别不同荧光标记的信标（FAM为绿色、HEX为黄色、TEX为红色），实现多重病原体的可视化检测（图2b-c）。信标浓度对可视化效果有显著影响，优化实验表明，0.6 μM浓度的信标能获得最佳检测效果（图2d）。

图2 应用分子信标的多重视觉检测方法

通过梯度稀释提取的基因组DNA并在快速扩增条件下进行可视化检测，结果显示检测限低至23拷贝每反应，与标准PCR的灵敏度相当(图3 a-b)。这一发现证实了MVPCR 方法不会影响扩增灵敏度。即使在超快速 PCR 的快速热循环条件下，分子信标也成功地与靶序列杂交，导致茎环展开并产生可见荧光。为了评估 MVPCR 方法的特异性，使用超快速PCR 检测了3种靶标病原体和5种非靶标病原体。凝胶电泳和标准PCR结果均仅显示 Sa、VP 和 IHHNV 的扩增产物和荧光信号，与可视化结果一致，证明了 MVPCR 方法在可视化多重病原体检测中的高特异性(图3 c-e)。

图3 MVPCR 法的灵敏性和特异性评估

在实际应用中，使用虾样本评估了所提出的方法。将一种或多种不同浓度的病原体加入虾样品，并通过基于 NaOH 的快速提取方法进行核酸提取，直接使用1 μL细胞裂解物作为模板进行多重检测（图 4a）。共分析了 20 个加标虾样本并进行标准 RT-PCR 作为参考。视觉检测结果与标准 PCR 的实时荧光曲线一致，证明了MVPCR法的可靠性、稳定性和高特异性（图 4b）。

图4 MVPCR法在加标虾样本中的检测应用

进一步地，所提出的方法被扩展用于检测易感染小鼠的病原体，包括铜绿假单胞杆菌（PA）、肺炎克雷伯菌（Kleb）和金黄色葡萄球菌（S. au）。在加标浓度范围为 10 至 10³ CFU/mL 的样品中，以标准 PCR 作为参考（图5 a-b）。对于 Ct 值超过 35 的低浓度样品，目视检测也能够轻松识别受感染样本并确定特定病原体，受感染样本表现出肉眼可见的荧光，未感染样本无荧光（图5 c）。因此，已建立的 MVPCR 方法具有很强的可行性，并且较容易适用于各个领域的多重核酸检测。

图5 MVPCR 方法同时检测三种低浓度病原体的可行性评估

研究结论

本研究成功开发了一种基于超快速PCR的多重病原体可视化检测方法，能够在10分钟内同时检测三种病原体。该方法结合了超快速PCR和分子探针技术，实现了高灵敏度（LOD为23拷贝）和高特异性的检测。与传统PCR方法相比，MVPCR法显著缩短了检测时间。通过自主开发的便携设备与在线分析系统，能够通过裸眼直接观察荧光信号，实现检测结果的简便输出，增加了其在资源有限环境中的应用价值。

Abstract

Pathogens pose significant threats to biosecurity and environmental health due to their potential for widespread outbreaks.

Effective pathogen detection requires methods that are rapid, sensitive, specific, and informative. Here, we proposed a multiplex visual detection system that integrated ultrafast polymerase chain reaction (PCR) and molecular beacons, allowing the simultaneous detection of three pathogens in a one-pot reaction. The ultrafast PCR protocol employed cycles of just 7 s each, allowing the entire process-from sampling to result-to be completed within only 10 min. Molecular beacons hybridized with target sequences during ultrafast PCR, generating fluorescence signals that are visually detectable without specialized equipment. Additionally, we developed a compact, portable cartridge integrated with online software for fluorescence visualization and direct result output, eliminating the need for bulky instruments and specialized personnel, thereby facilitating point-of-care testing (POCT). The method demonstrated high specificity and sensitivity, with a limit of detection (LOD) as low as 23 copies per reaction. It achieved a 100% positive detection rate in practical applications, performing comparably to standard PCR. Furthermore, the method effectively identified low concentrations of pathogens in animal infection samples. This ultrafast, highly sensitive, specific, and informative method shows significant potential for POCT applications, including food safety monitoring and clinical diagnostics.

作者简介

通讯作者

王瑞，上海市“启明星”人才，复旦大学青年副研究员。主要研究领域为：新型分子诊断方法开发和智能生物传感器构建。已主持国家级和省部级项目8项，包括：国自然面上项目，国自然青年项目，上海市“启明星”人才项目，上海市“科技创新行动计划”等。已经在本领域Top期刊Cell Discovery，Biosensors and Bioelectronics，TrAC Trends in Analytical Chemistry，Analytical Chemistry 等期刊上发表SCI论文45篇，其中以第一作者或通讯作者（含共同）发表SCI论文26篇，他引2000余次，2篇被Web of Science评为“高被引文章”，已申请发明专利16项。

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