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流式细胞术

流式细胞技术是一种对悬浮在流体中的单个细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。

『原理』：经荧光标记的细胞在鞘液包裹下形成单细胞流，依次通过激光检测区。激光照射细胞后会产生两种关键信号：散射光(反映细胞大小和内部复杂度)和荧光(揭示特定分子标记)。这些光信号被精密的光学系统接收并转换为电信号，经计算机处理形成直观图谱。——从而对异质性细胞群体进行细分与定量统计。

图 1.流式细胞术原理图^[1]。

此外，具备分选功能的仪器还能通过使液滴带电的方式，将特定目标细胞精准分离出来，从而实现高速、高纯度的细胞分选，广泛应用于免疫学、肿瘤学等研究领域。

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对照组设计

对照组的设置是实验的基石，其根本目的是确保实验结果的特异性、准确性和可解释性。

阴性对照

• Blank Control：空白对照/未染色对照，不加任何抗体的细胞。用来确定阴性细胞群的物理特性(大小、颗粒度)，作为调节电压的初始参考，并观察细胞的自发荧光背景。

• Isotype Control：同型对照，使用与一抗同种属、同亚型、同标记的非特异性抗体，用于排除抗体的非特异性结合。

生物学对照

• Positive/Negative Control：阳性/阴性生物学对照，已知表达/不表达目标抗原的细胞样本。

多色实验对照

• FMO Control：Fluorescence-Minus-One Control, 荧光减一对照。在一个多色染色 Panel 中，去掉其中一种抗体，其余抗体照常加入。在扣除一个颜色后，我们可以直观看到其他荧光基团在扣除颜色的通道上的溢漏，从而能更准确地设置圈门位置。

• Single-Stained Control：单阳管/单染对照，每管只加一种荧光标记的抗体。这是进行荧光补偿调节的关键！另外也可以协同调电压，防止阳性信号超出接收范围。

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实验流程

第一步：样本制备

『全血/PMBC』

1.红细胞裂解：使用红细胞裂解液，在染色后或染色前裂解红细胞。注意裂解后需用 PBS 充分洗涤。

2.密度梯度离心(如 Ficoll)：用于分离 PBMC，可获得高纯度的淋巴细胞。

『细胞系』

1.贴壁细胞系：用胰酶(含 EDTA)消化细胞。在显微镜下观察，当细胞变圆、间隙变大时，加入含血清的完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使其脱离培养皿表面，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管，300-500g 离心 5 min，弃上清，PBS 重悬洗涤。

2.悬浮细胞系：直接收集细胞培养液，300-500g 离心 5 min，弃上清，PBS 重悬洗涤。

『组织样本』

1.机械分离：在含血清的培养基或 PBS 中，用注射器活塞、研磨棒或 70μm 细胞筛网研磨。

2.酶学消化：对于致密组织(如实体瘤)，使用胶原酶、DNA 酶等混合酶液在 37°C 下消化 15-45 min，以解离细胞。注意处理后必须过70μm滤网，以去除细胞团块和碎片。

第二步：细胞计数与活力检测

『细胞计数』

使用血球计数板或自动细胞计数仪进行计数。

1.取少量细胞悬液，与台盼蓝或自动细胞计数仪专用染料混合。

2.进行计数，并计算细胞浓度和活力。活力应高于 90%。

『活力检测』

『原理』：死细胞容易与抗体非特异性结合，使用活性染料可以区分活细胞和死细胞，并在数据采集和分析过程中排除死细胞。

死活染料分为“可固定”与“不可固定”。核心在于染料分子是否能穿透完整的细胞膜，以及其与核酸结合的方式是否耐受固定剂(如多聚甲醛)的破坏。

第三步：固定和透化

『原理』：固定步骤是为了保留细胞内蛋白质的结构。 通透步骤会破坏细胞膜，使抗体进入细胞并对细胞内靶点进行染色。对细胞内靶点进行染色时，须进行额外的固定和通透步骤。

图 2. 固定和透化模式图。

『固定』

『操作』：

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛冰上固定细胞 15 ~ 20 min；

2. 洗涤：减速离心细胞(200 x g, 5 min, 4°C)得到沉淀，弃去上清液，并在洗涤缓冲液中重悬沉淀。清洗 3 次，以去除残留的固定液。

『注意』：

① 针对不同的抗原，需要优化固定步骤。

② 有些表位对甲醇非常敏感，因此如果检测出现任何问题，可以尝试使用丙酮。

③ 洗涤次数、离心时间和速度可能需要优化。

表1.常用固定试剂

『透化』

『操作』：

1.一边温和涡旋细胞，一边向细胞中缓慢添加预冷的甲醇，使细胞透化。

2.在冰上透化 10-20  min。

『注意』：

① 如果已使用有机溶剂(甲醇、丙酮)作固定剂，则不需要该步骤，因为丙酮也可以通透细胞。

② 最佳洗涤剂取决于蛋白及其定位。Triton 或 NP-40 等强效洗涤剂还会溶解部分核膜，因此适用于核抗原染色。而吐温 20 或皂素等温和洗涤剂，能够在不溶解质膜的同时使抗体穿过孔，因此适合细胞质中的抗原，或质膜的细胞质面和可溶性核抗原。

表2.常用透化试剂

第四步：封闭

该步骤用于减少非特异性结合，从而降低背景信号，提高信噪比和数据质量。可分为 Fc 受体封闭剂和非特异性蛋白封闭剂两类。

『操作』：

1.减速离心细胞(200 x g，5 min，4°C)得到沉淀，弃去上清液。

2.加入封闭缓冲液，轻轻吹打混匀重悬沉淀。4'℃ 避光孵育细胞 30-60 min。

第五步：抗体孵育

该步骤用使抗体充分与目的蛋白抗原结合，决定了荧光信号的位置和特异性，进而影响实验结果的准确性和可靠性。

该步骤可选择 (i)直接检测：一抗直接与荧光基团偶联。(ii) 间接检测：使用合适的荧光标记二抗检测一抗。这两种方法各有优点和缺点。

图 4. 直接法和间接法示意图。

『操作』：(以直接检测为例)

1.孵育：冰上或 4°C 避光孵育 20-30 min。

2.洗涤：加入过量洗涤缓冲液，离心(300-400g, 5 min)，弃上清。重复 1-2 次以去除未结合的抗体。

第六步：上机检测

抗体孵育后，将细胞充分重悬于适量 PBS 或鞘液中进行上机检测。

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[1] Zand E et al. Potential of Flow Cytometric Approaches for Rapid Microbial Detection and Characterization in the Food Industry-A Review. Foods. 2021 Dec 15;10(12):3112.