Advances in fluorescent nanoprobes for live-cell super-resolution imaging
Peng Xu, Zexuan Dong, Simei Zhong, Yu-Hui Zhang, and Wei Shen
Journal of Innovative Optical Health Sciences Vol. 18, No. 03, 2530001 (2025)
https://doi.org/10.1142/S1793545825300010
在生物医学光子学领域，超分辨成像技术正以前所未有的精度揭示细胞内的微观世界。《Journal of Innovative Optical Health Sciences》近期刊登了一篇题为“Advances in fluorescent nanoprobes for live-cell super-resolution imaging”的综述论文，由华中科技大学张玉慧教授和武汉市第四医院沈伟教授团队联合撰写，为这一领域的研究者们带来了新的启示与方向。
导语
细胞作为生命活动的基本单元，其内部的亚细胞结构和动态行为一直是生物医学研究的核心。然而，传统光学显微镜的分辨率限制使得许多小于 200 nm 的亚细胞结构难以被清晰观察。近年来，超分辨显微镜技术的飞速发展打破了这一限制，让活细胞内的纳米级结构和动态变化得以呈现。而荧光纳米探针（FNPs）的出现，更是为超分辨成像提供了性能卓越的工具，本文将深入探讨 FNPs 在活细胞超分辨成像中的应用与发展。
正文
文章首先介绍了超分辨成像技术的三种主流方法：基于光学传递函数扩展的宽场成像方法（如结构化照明显微镜 SIM）、基于点扩散函数调制的激光扫描成像方法（如受激发射耗尽显微镜 STED）以及单分子定位显微镜技术（如光激活定位显微镜 PALM 和随机光学重建显微镜 STORM）。每种方法都有其独特的成像原理和性能优势，例如 SIM 成像速度快但分辨率提升有限，STED 在分辨率和速度上表现出色但光毒性较大，而 SMLM 能实现高空间分辨率但成像速度慢且需要特殊荧光标记。
图1. 三种超分辨技术的原理。(a) 在结构化照明显微镜（SIM）中，样品通过非均匀的光模式结构进行照明，从而形成莫尔条纹。在获取大约15幅具有不同相位和方向的图像后，算法用于去除已知的照明模式，以重建高分辨率图像。(b) 在受激发射耗尽显微镜（STED）中，耗尽光束（呈甜甜圈形状）与聚焦的激发光相结合，将点扩散函数（PSF）的尺寸缩小到小于衍射极限的体积，从而提高成像分辨率。(c) 在单分子定位显微镜（SMLM）中，随机激活一小部分单分子荧光团，并在它们被失活之前获取其定位信息。通过重复这一循环，精确地定位每一个荧光团，并重建出超分辨图像。Reproduced with permission from Ref. 93.
在荧光纳米探针的开发与应用方面，研究者们取得了显著进展。例如，染料负载型纳米颗粒通过在表面修饰多个具有优异光学性能的荧光染料，提高了亮度和稳定性，被广泛应用于成像领域。2020 年，Diao 等人开发的 Cy5@Au NP 纳米探针，能够被动靶向溶酶体并通过内吞作用进入细胞，展现出对溶酶体微环境变化的高度耐受性以及低光漂白性，可用于溶酶体动态过程的长期标记和追踪。此外，金属簇因其独特的光学性质和良好的生物相容性，也被开发为超分辨成像探针。2022 年，Diao 团队开发的 BSA-Au NCs 和 BSA-Ag NCs 探针，能够在 SIM 成像下实现对溶酶体的超长期抗光漂白追踪，且不受 pH 波动影响。
图2. 活细胞中溶酶体的动态变化。(a) 使用Cy5@Au纳米颗粒染色的HeLa细胞在“亲吻-跑开”过程之前的SIM图像。(b) (a)中虚线框区域在“亲吻-跑开”过程中的放大图像。(c) 使用Cy5@Au纳米颗粒染色的HeLa细胞在融合之前的SIM图像。(d) (c)中虚线框区域在融合过程中的放大图像。(e) 使用Cy5@Au纳米颗粒染色的HeLa细胞在分裂之前的SIM图像。(f) (e)中虚线框区域在分裂过程中的放大图像。Reproduced with permission from Ref. 102.
对于 STED 成像，理想的探针需要具备高亮度、光稳定性以及与激发和耗尽光束波长匹配的发射峰等特性。碳点（CDs）因其优异的生物相容性、高光稳定性和可调谐的发射特性，成为 STED 成像的有力候选。2014 年，Pompa 等人首次将 CDs 应用于 STED 显微镜下的亚细胞成像，实现了从 170 nm 到 54 nm 的分辨率提升。聚合物点（PDs）也因其高亮度、抗光漂白性和低毒性，在 STED 成像中展现出巨大潜力。2018 年，Wu 等人采用 40 nm 的 PDs 进行 STED 成像，能够实现对活细胞内囊泡动态融合和分裂过程的可视化。
图6.活细胞内体相互作用的双色STED成像。(a)标记有两类Pdots的内体的共聚焦和STED图像。白色箭头指示通过STED纳米显微镜区分相邻的内体。(b)从共聚焦和STED图像中获得的内体大小分布。(c)通过双色STED纳米显微镜实时监测四个不同时间点的单个内体位置。(d)(c)中所示内体动态相互作用的示意图。(e)(c)中所示四个内体的轨迹。Reproduced with permission from Ref. 125.
在 SMLM 成像中，荧光探针需要具备可逆或不可逆的光转换、光激活或强光闪烁等特性，以实现暗态和亮态之间的循环。2021 年，Wiesner 等人开发的超小荧光核壳铝硅酸盐纳米颗粒，能够实现单激发源的 STORM 成像，并在常规（无毒性）成像缓冲液中使用。这些纳米颗粒通过共价封装有机荧光染料，提高了染料的亮度和光稳定性，使得研究人员能够在活细胞中实现 STORM 成像，并定量测量细胞内囊泡的大小和每个囊泡中的颗粒数量。
结语
荧光纳米探针与超分辨显微镜技术的结合，为深入探究细胞内的复杂动态提供了强大的工具。尽管 FNPs 在超分辨成像中取得了诸多突破，但仍面临诸如纳米颗粒尺寸较大、表面化学复杂等挑战，这限制了其在细胞内靶向递送和特异性标记亚细胞结构的能力。未来的研究需要致力于设计和合成更小、更亮的发光纳米颗粒，同时解决探针如何实现亚细胞结构特异性标记的问题。随着材料科学和纳米技术的不断发展，我们期待 FNPs 在超分辨成像领域带来更多创新成果，为生命科学的发展注入新动力。
通讯作者简介
张玉慧：华中科技大学武汉光电国家研究中心教授，研究方向为用于活细胞超分辨成像的有机荧光探针研究及其应用，细胞器互作方式、互作的动态过程和动态网络绘制。更多详情见：http://faculty.hust.edu.cn/zhangyuhui/zh_CN/index.htm
沈伟：武汉市第四医院神经内科主任、卒中中心主任，二级主任医师，教授，医学博士。长期从事脑血管病的基础及临床研究。
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