用于活细胞标记和成像的点击化学HaloTag配基

Clickable HaloTag ligands for live cell labeling and imaging

Yunhe Luo, Siyu Zhou, Mingyue Gong, Changfeng Wu, and Xiaofeng Fang

Journal of Innovative Optical Health Sciences Vol. 18, No. 03, 2441003 (2025)

https://doi.org/10.1142/S1793545824410037

在生物医学光子学领域，活细胞成像技术一直是探索细胞奥秘的关键手段。近期，《Journal of Innovative Optical Health Sciences》上发表了一篇题为《Clickable HaloTag ligands for live cell labeling and imaging》的研究型论文，为这一领域带来了新的突破。该研究由南方科技大学吴长锋教授团队房晓峰副研究员完成，他们开发了两种新型的生物正交点击化学小分子连接体--氯烷烃-四嗪（CA-Tz）和氯烷烃-叠氮（CA-N3），用于活细胞标记和成像，为活细胞成像技术的发展注入了新的活力。

研究背景与挑战

自标记标签蛋白（Self-labeling protein, SLP），如HaloTag，因其在活细胞标记中的特异性优势而备受关注。然而，可以直接用于蛋白质标记的氯烷烃底物的选择有限，限制了其广泛应用。2003年，Bertozzi提出了生物正交反应的概念，为解决这一问题提供了新思路。生物正交反应能够在不干扰生物自然功能的情况下进行，具有高生物相容性、特异性和多功能性，已在活细胞成像和分子标记中得到广泛应用。但如何通过生物正交反应增强SLP标签的广泛应用仍是一个挑战。

创新方法与实验

该团队成功开发了两种新型生物正交点击化学小分子配基CA-Tz和CA-N3。这些配基具有低分子量、良好的细胞膜穿透能力和生物相容性，能够将生物正交点击化学基团引入活细胞，实现对特定生物分子的标记和操控。研究中，团队将HaloTag基因整合到含有微管相关蛋白的载体中，构建了携带HaloTag基因的质粒，并将其瞬时转染到活细胞中，使HaloTag蛋白在微管结构上有效表达。随后，两种小分子配基分别与表达HaloTag蛋白的细胞孵育，通过点击化学反应与相应的荧光染料（如SiR-PEG3-TCO和SiR-PEG4-DBCO）共价结合，实现了对活细胞微管的高效标记。

图1. (a) 活细胞微管标记示意图；(b) CA-Tz和CA-N3的化学结构；(c) 点击化学SiR染料的化学结构。

实验结果与优势

实验结果表明，CA-Tz和CA-N3能够有效穿透细胞膜，实现对微管的特异性靶向标记。其中，CA-Tz和SiR-PEG3-TCO组合在标记上具有低非特异性吸附和高信噪比，而CA-N3和SiR-PEG4-DBCO组合则存在较强的背景噪声。图2展示了CA-Tz和SiR-PEG3-TCO标记的活细胞微管的共聚焦显微镜图像，荧光蛋白与染料的荧光信号完全重叠且背景噪声低。

图2. (a) 表达mEmerald-Halo-Ensconsin的微管；(b) SiR-PEG3-TCO标记的微管；(f) CA-Tz和SiR-PEG3-TCO标记的微管；(g) 共定位视图；(h) 强度分布曲线。

进一步的光稳定性测试显示，SiR染料在长时间激光照射下表现出比绿色荧光蛋白（如mEmerald）更优越的光稳定性，使其适用于长期超分辨成像。图4展示了CA-Tz和SiR-PEG3-TCO标记的微管在长时间成像中的光稳定性，与mEmerald相比具有显著优势。

图4. (a)-(d) CA-Tz和SiR-PEG3-TCO标记微管的时间序列图像；(e) 荧光强度随时间的变化曲线

此外，SiR染料标记的微管在四阶超分辨光学涨落成像（SOFI）中也显示出更高的结构保留率，与传统绿色荧光蛋白相比具有显著优势。图5展示了SOFI成像结果，SiR染料标记的微管在四阶SOFI图像中保留了更多结构细节。

图5.CA-Tz和点击化学SiR染料标记的以及表达mEmerald的活细胞微管的超分辨光学涨落成像（SOFI）。

主要创新点

●新型点击化学小分子配基的开发：CA-Tz和CA-N3的开发为HaloTag蛋白提供了新的氯烷烃基底物，扩展了其在活细胞标记中的应用范围。

●高效的活细胞微管标记：通过点击化学反应，实现了对活细胞微管的特异性标记，具有低背景噪声和高信噪比。

●优越的光稳定性：SiR染料在长时间成像中表现出比传统荧光蛋白更好的光稳定性，为长期活细胞成像提供了可能。

●超分辨成像的应用：在四阶SOFI成像中，SiR染料标记的微管结构保留率高，分辨率显著提高，为亚细胞结构的超分辨成像提供了新的工具。

应用前景

这项研究开发的点击化学HaloTag配基为活细胞研究提供了新的工具，不仅在基础生物医学研究中具有重要应用价值，还为药物开发和疾病诊断提供了新的可能性。例如，通过优化标记策略，可以实现对活细胞内多种亚细胞结构的特异性标记和动态监测，为研究细胞生理和病理过程提供更清晰的图像。此外，该技术还可应用于活细胞内的药物递送和生物分子相互作用研究，为开发新型治疗策略提供支持。

结语

这项研究不仅在活细胞标记和成像领域取得了重要进展，还为生物医学光子学技术的发展提供了新的思路和方法。通过开发新型点击化学小分子配基和优化标记策略，他们成功实现了对活细胞微管的高效标记和超分辨成像，为未来活细胞成像技术的进一步发展奠定了坚实基础。我们期待这一技术能够在更多领域得到应用，为生物医学研究带来更多的突破。

通讯作者简介

房晓峰，南方科技大学生物医学工程系副研究员，主要研究方向为有机功能材料的设计合成以及生物医学应用。

更多详情见https://www.sustech.edu.cn/zh/faculties/fangxiaofeng.html