研究背景
环境中人为来源化学混合物的日益复杂化对公众健康构成了重要且尚未充分描述的风险，其中发育中和成年期的神经系统因其结构精密和再生能力有限而尤为脆弱。与传统以单一化合物为主的历史污染不同，当代暴露更多涉及农业、工业和家庭来源的动态混合物，这凸显了传统风险评估方法的长期空白——即严重依赖单一化学物质的证据，难以捕捉混合物中可能发生的加和、协同或拮抗等交互效应。尽管神经系统是公认的环境毒物靶标，但复杂混合物引发协同神经毒性的具体机制仍未得到充分解析。
在环境混合物的常见组分中，新烟碱类农药 (如吡虫啉、噻虫胺) 和氟喹诺酮类抗生素 (如氧氟沙星、恩诺沙星) 因其广泛使用、环境持久性及已报道的神经相关效应而备受关注。新烟碱类农药在全球多地地表水和地下水中被频繁检出，浓度常超安全基准，其神经毒性除作用于烟碱型乙酰胆碱受体外，还与氧化应激、线粒体功能障碍及凋亡通路有关。氟喹诺酮类抗生素同样在受废水与农业活动影响的水环境中广泛存在，临床已证实其可引发失眠、头晕甚至癫痫等神经系统不良反应，机制涉及抑制性神经传递紊乱及氧化应激等。两类物质的共同存在为相互作用的神经毒性通路创造了合理场景。
值得注意的是，新烟碱类农药与氟喹诺酮类抗生素常在同一环境介质中共同存在，如中国多流域监测已发现两者联合检出，提示人类存在联合暴露可能。然而，关于两者共同暴露的生物学后果仍存在重大知识空白，混合物可能以单一物质研究无法预见的相互作用方式产生毒性效应。因此，解析混合物诱导的神经毒性需要采用生物学相关的实验模型和通路水平的读出示值，如人SK-N-SH神经母细胞瘤细胞系，并结合高通量转录组学 (如RNA测序)，以无偏倚地识别全基因组表达变化，揭示失调通路与基因网络，在系统层面描绘毒性特征。
研究成果简介
在单一暴露实验中，四种化合物 (吡虫啉IMI、噻虫胺CLO、氧氟沙星OFX、恩诺沙星ENR) 在24小时和48小时后均呈浓度依赖性地降低SK-N-SH细胞活力，且延长暴露时间 (从24小时至48小时) 进一步增强了毒性，表现出时间依赖性。通过剂量-反应曲线计算出的半数抑制浓度 (IC50) 显示，在两个时间点下，细胞毒性排序均为：ENR>OFX>IMI>CLO (IC50越低毒性越强)，表明氟喹诺酮类 (ENR、OFX) 的细胞毒性强于新烟碱类 (CLO、IMI)，其中ENR毒性最强，CLO最弱。在混合物相互作用评估中，将细胞以固定浓度 (各化合物自身IC50的50%) 联合暴露于两种或更多化合物，如下图中结果显示，在24小时和48小时，大多数混合物对细胞活力的抑制作用均强于相应的单一化合物暴露。具体而言，24小时时四种化合物混合物的活力降低作用最强；而48小时时，ENR+OFX混合物的降低作用最强，四种化合物混合物次之。
图1. SK-N-SH细胞在新烟碱类杀虫剂和氟喹诺酮类抗生素单独及联合暴露后的相对活力。(a) 暴露24小时后的活力。(b) 暴露48小时后的活力。数据表示为均值±标准误，n=5–7。
为表征新烟碱类杀虫剂与氟喹诺酮类抗生素单独或联合暴露对SK-N-SH细胞转录组的影响，进行了RNA测序分析。如图2所示，主成分分析显示，各处理组生物学重复聚类良好，整体可分为三个主要簇：CLO、IMI及CLO+IMI最接近对照组；OFX、CLO+OFX、IMI+OFX为第二簇；ENR、CLO+ENR、IMI+ENR及ENR+OFX距离对照组最远。这表明氟喹诺酮类 (尤其是ENR) 引起的转录组扰动显著强于新烟碱类。差异表达基因分析显示，二元混合物通常比单一化合物诱导更多的差异表达基因。单一化合物中ENR诱导的差异表达基因最多，OFX次之，CLO和IMI较少。二元混合物中CLO+OFX诱导的差异表达基因最多。
图2. SK-N-SH细胞在所研究化合物单独及联合暴露后的转录组学图谱。(a) 主成分分析 (PCA) 图，显示样本聚类情况。(b) 各处理组相对于对照组鉴定出的差异表达基因 (DEGs) 数量。
除此之外，KEGG通路富集分析表明，除CLO+IMI外，二元混合物富集的通路数量均多于单一化合物，其中ENR+OFX富集的通路最多 (35条)，与其强细胞毒性一致。单一暴露下，ENR和CLO主要富集于人类疾病和环境信息处理通路，OFX以代谢通路为主，IMI主要富集于环境信息处理。二元混合物富集通路多集中在人类疾病和环境信息处理。GO富集分析聚焦神经生物学功能，单一化合物暴露富集的GO项主要涉及神经发育和突触功能 (如突触组织、轴突导向、神经元分化等)，其中IMI的富集范围最广、统计信号最强。二元混合物不仅保留了核心的突触和轴突发生相关信号，还更显著地富集了神经营养因子结合及脑源性神经营养因子受体结合等分子功能，提示联合暴露可能更强调与神经元维持和可塑性相关的神经营养信号通路。
图3. 不同处理条件下SK-N-SH细胞中五个差异表达基因 (DEGs) 的验证。(a) RNA-seq得到的表达谱 (相对于对照组的相对倍数变化)。(b) RT-qPCR实验验证 (以β-actin归一化的相对倍数变化)。数据表示为均值±标准误，n = 3。与对照组相比，nsp > 0.05，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。
为验证转录组结果并聚焦神经生物学相关过程，选取了五个与神经发育、信号转导及细胞应激相关的基因 (LMO3、NOS1、ADCY8、TNFRSF12A、FGF7) 进行RT-qPCR验证。如图3结果显示，RNA-seq与RT-qPCR的表达变化趋势一致，证实了转录组分析的可靠性。LMO3、NOS1、ADCY8和FGF7在各处理中普遍下调，其中LMO3、NOS1和FGF7在ENR单独及含ENR混合物中下调最显著，而ADCY8在OFX单独及含OFX混合物中下调最显著。相反，与凋亡和炎症反应相关的TNFRSF12A在各处理中均表现为上调。这些结果进一步支持了联合暴露对神经发育、信号转导及细胞应激通路的调控作用。
研究总结
噻虫胺、吡虫啉、恩诺沙星和氧氟沙星均能剂量和时间依赖性地降低SK-N-SH细胞活力，其中氟喹诺酮类 (恩诺沙星、氧氟沙星) 毒性更强。固定比例混合物暴露常偏离浓度加和性，多个混合物尤其是48小时的恩诺沙星+氧氟沙星组合产生超加和 (协同) 效应。转录组学显示，含恩诺沙星的混合物诱导最强的基因表达扰动，富集细胞应激/损伤及神经元信号相关通路。RT-qPCR验证了五个神经相关基因的表达变化。结果表明，对共存的杀虫剂与抗生素进行混合物危害评估至关重要。未来需在环境相关浓度、长期/重复暴露及更生理的神经元模型中进一步验证。
作者简介
通讯作者
卢晓霞 副教授
卢晓霞，北京大学城市与环境学院副教授、博士生导师。主要从事污染土壤与地下水的微生物修复、新污染物的环境行为与效应等研究。2012年入选教育部新世纪优秀人才支持计划，主持或参与国家自然科学基金、国家重点研发计划项目等科研项目20余项。发表论文90余篇，授权发明专利4项，授权软件著作2项。获教育部高等学校科学技术奖自然科学奖1项，北京市科学技术奖2项。担任Toxics、Water Environment Research、《防化研究》等期刊编委。
第一作者
古丽加孜 博士研究生
古丽加孜，北京大学城市与环境学院地理学 (环境地理学) 专业2022级博士研究生在读，研究方向为环境健康。在科研成果方面，围绕新型污染物环境暴露人群健康风险评价等主题，在Toxics、Journal of Hazardous Materials、Sustainability 等期刊上发表论文8篇。参加国家自然科学基金2项、北京市自然科学基金1项。
阅读英文原文：https://www.mdpi.com/2305-6304/14/3/195
Toxics 期刊介绍
主编：Demetrio Raldúa, IDAEA-CSIC, Spain
期刊发表与有毒有害化学物质和材料相关的学术文章，主题范围涵盖毒理学、生态毒理学、环境科学、环境工程、环境化学和流行病学等学科。期刊已被SCIE (Web of Science)、PubMed、Scopus等多个数据库收录。
2024 Impact Factor：4.1
2024 CiteScore：6.4
Time to First Decision：17.8 Days
Acceptance to Publication：2.4 Days
期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/toxics
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