铁皮石斛是一种药食同源植物，主要由多糖、类黄酮和生物碱等组成。乙醇沉淀法可分离不同分子量得多糖组分。氧化损伤与肿瘤的发生和进展有着错综复杂的联系。细胞内和细胞外环境中的自由基可以通过基因突变来促进癌细胞的发育，并通过影响各种信号通路来调节肿瘤细胞增殖和凋亡。因此在研究天然物质的生物活性时，通常会同时进行体外抗氧化和抗肿瘤活性的分析。
烟台大学纪海玉博士天然产物与功能食品开发团队采用乙醇分级沉淀法分离出不同结构的铁皮石斛多糖，对其结构特性和抗肿瘤/抗氧化活性进行评价，综合分析乙醇浓度、多糖结构和生物活性之间的相关性。
研究过程与结果
不同乙醇浓度的沉淀组分通常在结构特征上表现出明显的变化，包括分子量分布、单糖组成和官能团分布。如图1所示，将铁皮石斛经95%乙醇预处理12 h，以去除色素、脂质和其他小分子物质。本实验采用热水提取和乙醇分级沉淀的方法，获得四种不同分子量的多糖组分DOP-1、DOP-2、DOP-4和DOP-S。
图1. 铁皮石斛多糖的制备工艺图
如图2所示，DOPs的分子量会随着保留时间的延长而降低，其中峰面积与相应分子量的多糖含量呈正相关。随着乙醇浓度升高，多糖组分的保留时间延长，表明平均分子量减小。
图2. DOPs的分子量分布结果
如图3所示，DOPs主要由甘露糖和葡萄糖组成。DOP-1、DOP-2、DOP-4和DOP-S分别由Man:Glc (摩尔比为3.38:1)、Man：Glc (摩尔比为 3.18:1)、Man：Glc：Ara (摩尔比为1.02:1:00:0.43) 和Man:Glc (摩尔比为0.12:1) 组成。
图3. DOPs的单糖组成结果
如图4所示。DOPs在3400~3450 cm−1和2850~2950 cm−1处均表现出明显的吸收峰，分别对应于O-H键和C-H键的拉伸振动，表明多糖具有特征性的吸收峰。特别是，在DOP-1和DOP-2中在1735 cm−1附近观察到的峰可归因于酯化羧基的羰基双键 (C=O) 以不对称拉伸方式的振动运动，表明乙酰基修饰位于Manp和Glcp的O-2处。在1640 cm−1和1420 cm−1附近检测到的相似吸收峰表明与结合水的O-H键和C-O键相关的振动。特别是在DOP-S中代表O-H官能团 (3416 cm-1和1618 cm-1) 的吸收峰表现出显著的信号增强和蓝移，表明对水的亲和力增加。分别在930 cm-1和870 cm-1附近观察到的吸收峰表明存在β和α-糖苷键，表明随着乙醇浓度的增加，这些馏分中的β-糖苷键含量增加。因此，这些结果揭示了DOP-1和DOP-2呈现乙酰化修饰，这可能是它们溶解度有限的原因。
图4. DOPs的官能团分布结果
如图5所示，DOPs在体外对H22细胞增殖表现出一定的抑制作用，呈剂量依赖性。其中，醇溶性成分DOP-S的肿瘤细胞增殖抑制率最好，在2.00 μg/mL时达到74%，这可能归因于优异的水溶性和较强的渗透性。
图5. 体外DOPs对H22细胞的抑制率
如图6所示，随着剂量的增加，DOPs对这些自由基的清除能力显着增加，并且DOP-S组分表现出优异的体外抗氧化作用，ABTS的最大清除率为75.5%，DPPH的最大清除率为73.1%。
图6. DOPs的体外ABTS和DPPH自由基清除率
作者建立了肿瘤小鼠模型用于DOP-S活性评估，结果如图7所示，DOP-S给药后荷瘤小鼠免疫器官重量有明显改善，平均肿瘤重量降至1.30 g和1.08 g，肿瘤抑制率分别为32%和43%。
图7. DOP-S对免疫器官和H22实体瘤的影响
如图8所示。与空白组相比，模型组SOD和GSH-Px活性明显受到抑制，而MDA含量明显增加，表明肿瘤生长诱导了机体氧化损伤。与模型组相比，DOP-S可以显著增强这些酶的活性，同时抑制荷瘤小鼠的MDA水平。
图8. DOP-S对荷瘤小鼠抗氧化酶活性的影响
研究总结
综上所述，乙醇分级沉淀法制备铁皮石斛多糖过程中，随着乙醇浓度的增加，获得的组分表现出分子量分布、甘露糖比例、乙酰化程度降低，而水溶性和葡萄糖含量增加。其中，DOP-S在体外和体内均表现出优异的抗肿瘤和抗氧化作用。这些数据将有助于铁皮石斛多糖在食品和医药工业中的进一步开发和应用，然而关于DOP-S中关键活性组分的结构特性及其活性作用机制仍需进一步分析。
阅读英文原文：https://www.mdpi.com/2720682
期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/nutrients
Nutrients 期刊介绍
主编：
Maria Luz Fernandez, University of Connecticut, USA;
Lluis Serra-Majem, University of Las Palmas de Gran Canaria, Spain
期刊主题涵盖常量营养素、微量营养素、生物活性营养素、运动营养、公共卫生和饮食相关疾病等学科领域。
2024 Impact Factor：5.0
2024 CiteScore：9.1
Time to First Decision：12.9 Days
Acceptance to Publication：2.3 Days
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