在生物技术和生物医学领域，重组蛋白的生产和纯化是关键步骤，直接影响下游应用的效率和成本。然而，传统的纯化方法如固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 虽然广泛应用，但仍存在操作复杂、成本高和规模化困难等问题。来自德国联邦材料研究与测试研究所 (BAM) 的Jule L. Völzke、Michael G. Weller及其团队在BioTech 期刊发表了一项突破性研究，介绍了一种基于功能化刚玉颗粒的高效、经济且快速纯化多聚组氨酸标签重组蛋白的新方法。这项研究为重组蛋白纯化提供了全新的解决方案，尤其适用于复杂基质和大体积低浓度样本。
研究背景与创新点
重组蛋白在癌症治疗、疫苗开发和生物分析等领域具有广泛应用，但其纯化过程往往成为制约因素。传统的IMAC方法依赖镍离子与组氨酸标签的相互作用，但通常需要繁琐的优化步骤和昂贵的层析柱设备。本研究团队开发了一种基于功能化刚玉颗粒的纯化平台，通过表面修饰和镍离子负载，实现了高效、低成本的蛋白纯化。
刚玉颗粒具有极高的物理和化学稳定性，成本仅为传统琼脂糖珠的百分之一。研究团队首先将刚玉表面氨基硅烷化 (APTES修饰)，随后与乙二胺四乙酸二酐 (EDTAD) 反应形成螯合配体，最后负载镍离子。这种设计不仅简化了纯化流程，还显著提高了纯化效率和产物纯度。
研究过程与结果
1. 功能化刚玉的制备与表征
研究团队通过凯撒试验 (Kaiser test) 和ICP-MS验证了刚玉表面的成功修饰和镍离子负载。结果显示，功能化刚玉的镍结合容量高达5.2 µmol/g左右，远超未修饰材料的背景值。这种高负载量为重组蛋白的高效捕获奠定了基础。
2. 蛋白纯化性能测试
以组氨酸标签蛋白A/G (His6-PAG) 和牛血清白蛋白 (BSA) 的混合物为模型系统，研究团队优化了结合和洗脱条件。实验表明，在结合缓冲液中加入20 mM咪唑时，纯化产物的纯度最高，且蛋白结合容量达到3 mg/g刚玉。即使在复杂基质 (如大肠杆菌细胞裂解液) 中，功能化刚玉仍能高效选择性捕获目标蛋白。
3. 实际应用验证
研究团队进一步验证了该方法在真实场景中的适用性：
大肠杆菌表达系统：成功纯化了细胞质中表达的His6-MBP-mSA2融合蛋白 (60 kDa)，纯度优异。
哺乳动物细胞培养上清：从人Expi293F细胞中纯化了SARS-CoV-2-S-RBD-His8蛋白 (23.4 kDa)，证明了其在真核表达系统中的适用性。
大体积低浓度样本：从1000 mL低浓度样本 (1 μg/mL) 中成功富集目标蛋白，展现了其规模化应用的潜力。
与商业镍-NTA琼脂糖珠相比，功能化刚玉纯化的蛋白纯度更高，且成本极低 (每克材料成本不足30欧分，每毫克纯化蛋白成本约10欧分)。
研究总结
本研究采用高纯度刚玉粉末开发了一种新型亲和纯化平台，其原理基于镍离子与多聚组氨酸标签的经典相互作用。ICP-MS分析证实了材料表面修饰与镍负载的成功实现。即使从未经优化的大肠杆菌裂解液中纯化蛋白，也能获得预期产量且重组目标蛋白纯度优异。与商业镍-NTA琼脂糖珠标准方案相比，刚玉方案的洗脱产物杂质更少。在实际应用案例中，研究团队分别从大肠杆菌和人细胞培养上清中成功纯化了重组融合蛋白His6-MBP-mSA2和SARS-CoV-2-S-RBD-His8。
这种无层析柱的操作方式结合刚玉材料的极低成本，使得放大生产变得简单直接，有望突破固定化金属亲和分离技术在工业应用中的局限性。刚玉材料还具有以下优势：多种粒径可选、极高的物理化学稳定性、因无孔隙结构实现的快速结合/洗脱动力学、灵活的表面化学修饰选项以及无需额外浓缩步骤的富集能力。其缺点在于单位体积或重量的载量因缺乏内部孔隙而受限，但可通过增加这种廉价材料的用量轻松弥补。该技术还能处理大体积低浓度上清液，且悬浮物不会引发柱式亲和法中常见的压力问题。由于成本极低，刚玉材料可作为一次性耗材使用，避免了繁琐的再生和去污染流程，从而彻底解决了再生过程中的载量损失、残留携带和消毒问题。相较于标准NTA材料，其更优越的螯合结构还能最大限度减少镍离子泄漏。
原文出自 BioTech期刊：https://www.mdpi.com/2277142
期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/biotech
BioTech 期刊介绍
主编：Prof. Dr. Massimo Negrini, University of Ferrara, Italy
期刊主题涵盖食品研究相关各方面。目前已被 Scopus、SCIE (Web of Science)、PubMed 等数据库收录。
2024 Impact Factor：3.1
2024 CiteScore：4.8
Time to First Decision：26.1 Days
Acceptance to Publication：2.6 Days
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