近日，山东大学微生物改造技术全国重点实验室祁庆生团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表了题为“Engineering Yarrowia lipolytica as a yeast cell factory for the de novo production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)”的研究成果。该研究选用琥珀酸脱氢酶缺陷型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为底盘菌株，采用亚细胞分区策略，使用来源于线粒体的4-羟基丁酸（4HB），在胞质内合成聚（4-羟基丁酸）（P4HB）。进一步引入3-羟基丁酰辅酶A的生物合成途径，首次在胞质内实现了3-羟基丁酸（3HB）单体和4HB单体的共聚。通过改变培养基组分，聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（P34HB）中4HB单体比例可以由9.17 mol%调整至45.26 mol%。在5L生物反应器进行分批补料发酵时，P34HB滴度达到18.61 g/L，占细胞干重（CDW）比例达到19.18%。本研究拓展了酵母细胞工厂合成聚羟基脂肪酸（PHA）可用的单体库，也证明了Y. lipolytica在PHA合成中的潜力。
01
研究背景
聚羟基脂肪酸（PHA）是由微生物在环境胁迫下合成的生物聚酯，聚（3-羟基丁酸）（PHB）是最常见的PHA，但其具有脆性较大的缺点；聚（4-羟基丁酸）（P4HB）则具有卓越的柔韧性、弹性和延展性；聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（P34HB）是由3-羟基丁酸（3HB）单体和4-羟基丁酸（4HB）单体共聚而成，通过调整4HB单体比例，可以自由定制不同柔韧性和拉伸强度的P34HB，在医疗、包装等领域具有巨大的潜力和市场价值。P34HB的生物合成主要依赖于细菌平台，但是细菌平台存在的固有局限性，如体积生产率低、需要添加相关碳源、基因编辑手段不成熟等，限制了P34HB生物合成的发展。Y. lipolytica具有高生物量、底物利用范围广、代谢通量大、改造手段成熟等优势，是PHA细胞工厂的有力候选者。本研究开发了合成P34HB的Y. lipolytica细胞工厂，首次在Y. lipolytica中实现了P34HB的合成，为Y. lipolytica细胞工厂高效合成P34HB提供了见解。
02
研究内容
1、Y. lipolytica中4HB单体的合成
4-羟基丁酸（4HB）是合成P4HB的前体，本研究首先使用了来源于P. gingivalis的琥珀酸半醛脱氢酶（SucD）和4-羟基丁酸脱氢酶（4Hbd）构建4HB生物合成途径（图1A）。由于琥珀酸（SA）是4HB的间接前体，分别选择了Po1f、PGC62和PGC91菌株作为底盘。PGC62和PGC91菌株是实验室前期构建的两株琥珀酸脱氢酶（SDH）缺陷型菌株，具有SA积累的特性。SucD的直接前体是琥珀酰辅酶A，因此通过添加信号肽的方式将异源的4HB合成途径定位在线粒体中，构建了P1、P2、P3菌株。结果表明，P1、P2、P3菌株分别积累了14.84 mg/L，29.33 mg/L和41.50 mg/L的4HB（图1B）。SDH缺陷型菌株4HB滴度更高，表明TCA循环的阻断产生较高的琥珀酰辅酶A溢流更有利于4HB的合成。引入4HB途径后，菌株生长较之前降低了5.41-31.62%，则是由于额外的代谢负担和琥珀酸半醛（SSA）、4HB造成的细胞毒性导致。
2、Y. lipolytica中构建P4HB生物合成途径
聚（4-羟基丁酸）（P4HB）的合成需要活化的4-羟基丁酰辅酶A作为前体，分别选择了来源于P. gingivalis的4-羟基丁酰辅酶A转移酶（Cat2）和N. maritimus的4-羟基丁酰辅酶A合酶（PatZN）；4HB单体的聚合则选择了来源于C. necator的PHA合酶（PhaC）。由于4HB单体合成的初始位置是线粒体，因此分别将Cat2和PatZN依赖的P4HB合成途径分别引入P3菌株的线粒体和细胞质中，构建了P4-P7菌株（图1A）。结果表明，P4-P7菌株分别积累了386.76 mg/L（2.25% CDW），460.06 mg/L（2.82% CDW，493.62 mg/L（2.95% CDW）和472.33 mg/L（2.81% CDW）（图1C）。P4HB合成途径在不同细胞分区中的效率存在差异，PatZN途径在线粒体中滴度更高，而Cat2途径则在胞质中表现更优，这与不同分区中的辅因子和前体可用性相关：Cat2需要胞质中丰富的乙酰辅酶A，而PatZN则更依赖线粒体中丰富的ATP和游离的CoA。胞质定位的P4HB合成途径更加高效表明细胞质相比线粒体更有利于胞内产物的积累。在发酵液中同时出现了4HB积累表明了当前P4HB合成途径强度不足。通过在P6菌株中进一步过表达Cat2和PhaC，构建了P8菌株。P4HB滴度达到622.78 mg/L（4.74%CDW），较P6菌株分别增加了60.68%和26.17%（图1C）。
3、引入3-羟基丁酰辅酶A的生物合成途径用于P34HB合成
聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（P34HB）的合成需要3-羟基丁酰辅酶A和4-羟基丁酰辅酶A同时作为3-羟基丁酸（3HB）单体和4HB单体的供体。选择了来源于Streptomyces sp.的乙酰乙酰辅酶A合酶（NphT7）和C. necator的乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）在P8菌株中构建3-羟基丁酰辅酶A的合成途径，得到P9菌株（图2）。P9菌株共积累了1.33 g/L（10.14% CDW）的P34HB，其中4HB单体比例达到46.94 mol%（图3）。3HB单体的掺入显著提高了PHA的滴度和含量，分别较P8菌株提高了114.52%和113.92%。此外，在发酵液中检测到了0.64 g/L的3HB，表明当前PhaC活性不足以消耗全部的3-羟基丁酰辅酶A，过量的3-羟基丁酰辅酶A被内源硫酯酶水解，产生3HB的积累。在P9菌株中进一步过表达PhaC，构建了P10菌株，P34HB积累达到1.60 g/L（11.71% CDW），分别较P9菌株提高了15.48%和20.30%（图3）。同时3HB积累减少了23.44%，这表明了PhaC的表达强度是PHA积累的关键限制因素。
4、P34HB合成培养基的组分优化
不同的培养基组分和碳源会显著影响工程菌株的生长和代谢，分别选择了丰富培养基（YPD和YPG）和基本培养基（CM1D和CM1G）在摇瓶中测试了P10菌株的P34HB合成情况。结果表明，P10菌株在不同培养基中合成P34HB的滴度和组成存在差异。在YPD，YPG，CM1D和CM1G中分别积累了1.60 g/L（11.71% CDW，45.26 mol% 4HB），1.34 g/L（11.52% CDW，34.46 mol% 4HB），1.57 g/L（16.68% CDW，9.17 mol% 4HB），1.97 g/L（13.68% CDW，15.28 mol% 4HB）的P34HB（图4）。使用YP培养基时4HB单体比例较高，这得益于YP培养基中丰富的营养成分促进了TCA循环，从而推动碳源流向4HB的合成。在CM1培养基中，3HB单体比例和P34HB含量更高，表明CM1可能更有利于将碳源导向脂肪酸的合成，过量的乙酰CoA同时促进了3HB 单体的合成。
5、5L发酵罐中进行分批补料发酵
P34HB是胞内积累产物，其滴度与菌株的生物量偶联相关，而含量则更能体现菌株积累P34HB的能力。由于P10菌株使用CM1D和YPD培养基在摇瓶发酵时得到了更高的P34HB含量，因此选择这两种培养基在5L发酵罐中进行分批补料发酵。在使用CM1D或YPD培养基时，P34HB积累分别达到18.61 g/L（16.70% CDW，29.89 mol% 4HB）和13.34 g/L（19.18% CDW，31.91 mol% 4HB）（图5）。与摇瓶发酵相比，OD600分别达到了149.54和106.02，推动P34HB滴度分别提高了10.85倍和7.34倍。使用YPD培养基时，TCA循环较强，推动了4HB单体合成，同时脂肪酸合成相对较弱，使更多乙酰辅酶A用于3HB单体的合成，共同促使了较高的P34HB含量；而CM1D则更有利于细胞生长，较高的生物量尽管竞争了更多的碳源，但同时也带来了更高的P34HB滴度，表明平衡细胞生长与P34HB合成是综合提高P34HB积累的关键。而在5L发酵罐中，由于复杂的条件控制，培养基对4HB单体比例的影响被削弱。当使用尼罗红染料对P10菌株在CM1D和YPD培养基后期的细胞进行染色，荧光观察时，能清楚地看到胞内积累的PHA颗粒（图6）。
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