Nature：没电了？闪充已就位（下篇）
初稿 | 丁祎楠
校对 | 高铭远小编注 | 高铭远 生茂正 石丽排版 | 丁祎楠编辑 | 孟美瑶
6、 线粒体与NPC接触缺失引起的体外细胞下游效应
随后，研究人员探究了RKO细胞核内能量状态降低所引起的下游影响。细胞核内DNA合成、修复、转录和染色质修饰等过程均需要消耗大量能量。上述过程大多依靠蛋白质磷酸化修饰调控，而磷酸化本身是高度依赖ATP供能的生化反应。因此研究人员进行了磷酸化蛋白质组学分析，来探究RKO细胞核内的蛋白磷酸化是否发生改变（补充表6），结果显示RKO细胞核中整体蛋白磷酸化水平显著降低（图4A上），而细胞核外的多肽磷酸化水平没有变化（图4A中），此外核蛋白质组学发现野生型与RKO细胞之间的核内激酶水平没有显著差异（图4A下、补充表7），说明RKO 细胞核整体蛋白磷酸化水平显著下降不是细胞核内激酶总量减少所致，而更可能是由于可用于ATP再生的PCr供应不足（小编注：核内除PCr–CK系统外，还可能通过以下途径获得ATP：1、线粒体氧化磷酸化产生ATP释放到细胞质基质，通过扩散进入细胞核；2、糖酵解：胞质糖酵解直接产生ATP，扩散进入细胞核；3.腺嘌呤核苷酸激酶（AK）系统：当核内ATP被大量消耗时，AK催化可逆反应：2ADP ⇌ ATP + AMP，通过重新分配腺苷酸池来维持局部ATP水平，再由氧化磷酸化或糖酵解补充ATP）。
已知EGF处理可通过PKA 激酶使细胞核内 CREB 蛋白发生磷酸化，于是研究人员用EGF刺激WT和RKO细胞5 min；结果发现RKO细胞中磷酸化CREB水平显著降低（图4B）。而 刺激后WT与RKO细胞的核内PKA水平没有差异（图S5H），这证实核内靶蛋白磷酸化受损是由于局部能量供应不足，而非PKA核转运异常。研究人员进一步对RKO细胞中磷酸化下调的肽段进行通路富集分析发现DNA复制、损伤修复、染色质结构和胚胎发育过程相关通路均发生明显紊乱（图S6A、补充表8）。
为探究分子层面缺陷是否进一步引发转录变化，研究人员进行了RNA测序（RNA-seq），差异表达分析鉴定出5,934个差异表达基因（补充表9）；其中下调基因显著富集于蛋白质磷酸化、基因转录和细胞分化相关通路（图S6B、补充表10）。随后，研究人员进一步检测了表观遗传变化情况，ChIP-seq检测到RKO细胞基因启动子区整体组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）修饰水平降低（图4C、补充表11）。但由于H3甲基化修饰本身并不消耗ATP，因此研究人员认为该表观改变属于继发性效应。相比之下，染色质“开放性”受ATP依赖性核小体重定位调控，ATAC-seq结果显示RKO细胞启动子区的峰显著减少，即染色质整体更紧缩、染色质可及性降低（图4D、补充表12），说明了核内ATP和PCr水平下降会直接损害ATP依赖性染色质重塑（小编注：乙酰化修饰通过中和组蛋白赖氨酸正电荷削弱组蛋白-DNA相互作用、招募转录激活复合物形成有利于开放的染色质环境，该过程不需要 ATP 水解供能。而后染色质重塑复合物的 Snf2 ATP 酶结构域水解大量 ATP 获取机械能，破坏核小体 DNA 与组蛋白之间的结合作用力，驱动启动子区域核小体滑动移位、解离移除，使 DNA 序列暴露，提升染色质可及性，该过程需要消耗大量ATP，因此ATP 是核小体重定位、染色质重塑过程提供必需的机械能量）。整合上述数据集后研究人员发现转录下调、染色质表观遗传改变（H3K27me3图谱改变)及染色质紧缩信号降低均一致富集于发育过程（图4E、补充表13）。并且研究人员发现SMAD蛋白家族（SMAD）、GATA结合蛋白家族（GATA）、叉头框蛋白家族（FOX）和T-box转录因子家族（TBX）等参与分化的关键转录因子家族功能普遍受损（图S6C）。
拓展阅读： ATP依赖性染色质重塑
ATP依赖性染色质重塑是指细胞利用ATP水解释放的能量，在SWI/SNF、ISWI、CHD、INO80等重塑复合物介导下主动改变核小体在DNA上的位置，从而调控染色质开放性的过程。
整个过程可概括为四个协同的步骤：首先，染色质重塑复合物识别并结合到核小体上的特定区域，随后复合物中的ATP酶亚基水解ATP，释放的能量引起复合物自身的构象发生显著变化，并将这种化学能转化为作用于核小体的机械力，紧接着，这种机械力被传递至核小体核心，破坏DNA与组蛋白之间的静电相互作用与氢键结合，进而驱动核小体沿DNA链滑动、核小体移除、间距重排或组蛋白变体置换，实现核小体动态重定位。该过程可直接调控基因组DNA的暴露程度，决定转录因子、RNA聚合酶等转录核心元件能否结合基因启动子与调控区域，是维系正常基因转录、染色质稳态的基础。由于该过程的每一个环节都需要ATP水解提供能量，因此染色质重塑是一个严格依赖ATP的主动、耗能的物理运动。
组蛋白修饰可作为识别标签招募特异性染色质重塑复合物，靶向介导局部核小体重定位，其中组蛋白乙酰化特异性招募 SWI/SNF 等激活型染色质重塑复合物，促进核小体解离、染色质开放，组蛋白甲基化可招募 CHD 重塑复合物开放染色质也可招募 PRC、NuRD 等抑制型重塑复合物，压缩染色质、沉默转录。此外核小体动态移位可暴露组蛋白尾部区域，提升乙酰化酶、甲基化酶的修饰效率，二者协同维持染色质稳态与基因转录的精准调控。
为从功能层面验证这些分化缺陷，研究人员使用5-氮杂胞苷诱导10T1/2细胞分化为肌管和脂肪细胞。结果发现与野生型细胞相比，RKO细胞分化形成的细胞数量显著减少，细胞成熟谱系标志物基因表达显著下调（图4F-H），证实RANBP2缺失会严重损害细胞分化能力。研究人员同时发现RKO 细胞的糖酵解和三羧酸循环相关酶蛋白水平未发生显著改变（图S7A、图S7B），全细胞总ATP、肌酸和PCr水平也未发生变化（图S7C、图S7D）。此外，[¹³C]葡萄糖代谢流示踪结果显示糖酵解、磷酸戊糖途径代谢物的稳态水平均未受影响（图S7E-G）。以上结果表明，核内能量缺陷属于局部效应，不会导致细胞整体发生代谢障碍。
随后，研究人员探究了VDAC1点突变或RANBP2-CTD缺失是否能够在人诱导多能干细胞中重现RANBP2全长敲除所见表型，于是研究人员利用CRISPR技术构建了两类人诱导多能干细胞系：一种携带VDAC1 ETT→LII突变，另一种缺失RANBP2-CTD。研究人员首先评估这些修饰是否影响蛋白定位及已知的CTD非依赖性功能，结果发现VDAC1突变不影响其线粒体定位（图S8A）；且截除CTD后的RANBP2仍保留原有的不依赖CTD的功能：包括PolyT荧光原位杂交未检出mRNA核输出缺陷（图S8B）；表达H2AX-绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的有丝分裂细胞活细胞成像中，有丝分裂频率和染色体异常均无差异（图S8C）；SUMO-Ran共免疫沉淀确认RANBP2的SUMO化功能完好（图S8D）。
在验证这些模型后，研究人员观察到CTD截短和VDAC1突变的人诱导多能干细胞均表现出核内PCr含量显著下降（图4I、图4K）。诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞分化后，两种细胞系的早期（第4天）和晚期（第6天）分化标志物表达均显著降低（图4J、图4L）。这些结果进一步表明VDAC1与RANBP2-CTD的特异性相互作用对核内能量稳态和心肌细胞分化具有关键作用。
总体而言，体外结果支持如下模型：线粒体产生的ATP和PCr通过VDAC1-RANBP2-CTD锚定连接递送至细胞核；核内肌酸激酶使这部分能量得以在局部利用，从而驱动磷酸化、转录和染色质动力学，并直接影响细胞生长和分化（图S9）。
图4:RKO细胞的转录组学和蛋白质组学分析
图S6 RANBP2敲除细胞中的RNA-seq、H3K27me3 ChIP-seq和ATAC-seq
图S7 RANBP2敲除细胞系中的线粒体蛋白质组和代谢
图S8 RANBP2和VDAC1突变iPSC细胞系
7、线粒体与NPC结合的体内生理功能
基于上述体外细胞实验的结果，研究人员进一步探究了体内线粒体-NPC接触缺失引发的生物学效应。已有文献报道RANBP2全基因敲除小鼠在胚胎发育期死亡。于是研究人员构建了一个由CRISPR-Cas9介导的RANBP2 C端结构域截短小鼠模型，即RANBP2 C端结构域截短（RANBP2ΔCTD；图5A、图S10A-C）。纯合CTD截短突变会导致胚胎致死，胚胎在E10.5仍符合孟德尔比例，但在E14.5已不能检出，提示其在此期间死亡（图5B）。此外在E10.5时，KO胚胎整体明显小于WT同窝胚胎（图5C）。对E10.5神经管进行TEM分析证实，KO胚胎的线粒体外膜与NPC之间的距离显著增加，且该变化特异发生于核孔复合体处，而线粒体与普通核膜整体的邻近关系未受影响（图5D、图5E）。
研究人员进一步对 E10.5 胚胎组织进行病理学切片发现在E10.5时，KO胚胎两个心室的心肌壁均显著变薄（图5F、图5G）。TUNEL染色结果证实两组胚胎心肌细胞凋亡水平无差异，因此心肌变薄并非细胞凋亡增多导致（图S10D）。此外KO胚胎头侧区域还出现显著神经管闭合不全发育畸形情况（图5H），但胸段脊髓厚度保持正常（图5I）。
体外细胞实验证实RANBP2缺失可导致细胞DNA复制及转录异常，研究人员进一步检测了胚胎心脏和神经管中的细胞增殖与分化是否受到影响。研究人员使用有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3（pH3）染色并定量pH3阳性心肌细胞后发现，突变体致密心肌中的pH3阳性细胞显著增加（图5J、图5K），但总心肌面积反而减小了（图5L）。为确定这一现象是否源于细胞周期动力学改变，研究人员采用了EdU和BrdU双脉冲标记技术，从而精确计算细胞S期时长（Ts）和总细胞周期时长（Tc）。结果显示虽然更多心肌细胞掺入BrdU或EdU，增殖细胞数目变多，但两种基因型之间的Ts或Tc均无显著差异（图5M、图5N），但过度增殖的心肌细胞体积显著更小（图S10E）。对比发育阶段特征发现E10.5时期的RANBP2ΔCTD心脏与正常E9.5心脏高度相似（图S10F），这表明突变体心脏表现为胚胎发育迟缓，心肌细胞停留在祖细胞样增殖状态，无法成熟、增大和分化。
研究人员还检测了神经管中的细胞增殖和早期神经元分化标志物III型β-微管蛋白(Neuron-specific class III beta-tubulin,Tuj1)结果发现两种基因型的pH3阳性细胞核无差异（图5O、图5P），但KO胚胎的Tuj1阳性面积减少，说明神经元分化受损（图5Q）。神经管的EdU-BrdU双标记中，突变胚胎细胞EdU和BrdU掺入比例增加（图5R、图5S），Ts不变，但Tc显著缩短，约为7.5h，而WT约为11h（图5S下）。在神经发育中，较短的细胞周期通常对应神经祖细胞扩增，而细胞周期延长，尤其是G1期延长，则是神经元分化的重要特征。因此，KO胚胎细胞周期缩短提示神经祖细胞未能及时退出增殖状态，从而导致神经发育延迟。
上述结果表明，RANBP2-CTD介导的线粒体-NPC锚定连接对于胚胎发育过程中细胞分化至关重要；其缺失导致心脏和神经管区域呈现祖细胞样、分化不足的状态，并最终引起发育迟缓。
图5:体内删除RANBP2-CTD
图S10 RANBP2 C端结构域截短小鼠模型
总结
本研究阐明了RANBP2-VDAC1介导的线粒体-核孔复合体（NPC）直接锚定连接，为线粒体与细胞核之间的局部能量耦联提供了新的分子机制。该连接有助于将线粒体来源的ATP和磷酸肌酸定向输送至细胞核，从而维持核蛋白磷酸化、染色质开放状态及细胞分化程序；连接受损则导致核内能量稳态失衡、细胞分化受阻及胚胎发育迟缓。此外，该研究还提示，核周线粒体除承担能量供给功能外，还可能作为局部代谢物和应激信号传递的重要平台。
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