Science：线粒体“撸串”的学问（上篇）
初稿 | 丁祎楠
校对 | 石丽小编注 | 高铭远 生茂正 石丽排版 | 丁祎楠编辑 | 孟美瑶
线粒体携带着能够独立复制的基因组——线粒体DNA（mtDNA），这被认为是其内共生起源的遗留特征。在人类中，mtDNA编码氧化磷酸化系统的13个核心亚基以及其表达所需的RNA。因此，mtDNA完整性和拷贝数的维持对于线粒体功能和细胞健康至关重要，其破坏会导致一系列代谢和神经疾病。每个有核的人类细胞含有数百到数千个mtDNA拷贝，这些拷贝被包装成核样体，并被内膜嵴的内陷局部限制。
规则的间隔使得子细胞在分裂过程中能够精确地继承mtDNA，并且使基因表达沿线粒体的分布保持均匀。然而，目前尚未发现能够分离核样体或建立并维持其规则间隔的分子机制（小编注：最早在2016年Science文章中对酵母mtDNA进行研究，通过定量活细胞成像标记线粒体（matrix-targeted mCherry）、细胞核（GFP）和mtDNA（EdU），通过计算mtDNA之间的距离，研究细胞分裂时线粒体和mtDNA的变化，并发现mtDNA被包装成线粒体核样体（Nucleoids），然后这些Nucleoids在线粒体网络内呈半规则、均匀间隔分布。后来，2021年Scientific Reports文章A new automated tool to quantify nucleoid distribution within mitochondrial networks上报道，哺乳动物线粒体也存在类似的情况）。线粒体动力学缺陷会扰乱核样体的稳态，但在酵母中缺乏分裂和融合、或在人类中缺乏分裂和膜连接的情况下，线粒体仍能维持核样体的正常分布。
拓展阅读：线粒体核样体相关研究
早期研究表明，mtDNA并不是以游离形式存在，而是被包装成线粒体核样体（Mitochondrial Nucleoids），并沿线粒体网络呈非随机、半规则分布。在2016 年发表于Science的研究中，作者Jajoo以裂殖酵母为模型，通过定量活细胞成像同时标记线粒体、细胞核和 mtDNA，结合线粒体网络重建和核样体间距分析，发现mtDNA-containing nucleoids在线粒体内部呈半规则排列。需要注意的是，在酵母中mtDNA 的主要包装蛋白更常被认为是Abf2，而哺乳动物中则主要是 TFAM。
此外，Osman等人在酿酒酵母中利用LacO-LacI系统非侵入性追踪 mtDNA 动态，发现即使同时敲除Dnm1（控制线粒体分裂）和Fzo1（控制线粒体融合），细胞仍能维持mtDNA的分布和遗传，提示mtDNA核样体的空间组织并不完全依赖经典的线粒体分裂/融合循环。后续在人类和哺乳动物细胞中的研究也发现，核样体在线粒体网络中具有类似的半规则间距。虽然在先前的文献中，已发现存在ER-线粒体接触、线粒体分裂以及膜锚定/膜连接等多种机制参与mtDNA复制、分配和运输，但这些机制本身不足以完全解释核样体间距的高度稳定性。在本文中，作者进一步提出，线粒体串珠化可能通过物理性分隔和重新分配mtDNA核样体，建立并维持这种规则间距。
参考文献：
[1] Jajoo et al., Science. 2016 Jan 8;351(6269):169-72.
[2] Ilamathi et al.,Sci Rep. 2021 Nov 23;11(1):22755.
[3] Osman et al.,PNAS. 2015 Mar 3;112(9):E947-56.
线粒体的“串珠化”现象类似于由弹性与表面张力竞争所驱动的普拉特-雷利不稳定性，它会引发线粒体从管状结构向“串珠”的形态转变。这种同时发生且间隔均匀的收缩现象曾有零星报道，并被认为可能是分裂的启动步骤。研究数据表明，线粒体的“串珠化”是真核生物线粒体动力学中一种快速、频繁且通常可逆的生理事件。在本研究中，研究员结合了超分辨率、无标记和电子显微镜技术，以及对钙离子内流、嵴形态、膜连接和线粒体分裂进行的药理学和遗传学调节，旨在阐明“串珠化”在重新分配线粒体DNA复制本和建立长期神秘的核样体规则间隔中的新兴功能作用。
2026年4月2日，瑞士洛桑联邦理工学院Suliana Manley团队在Science在线发表题为“Pearling drives mitochondrial DNA nucleoid distribution”的研究论文，该研究发现线粒体经常经历一种可逆的生物物理不稳定现象，称为“串珠化（Pearling）”，即从管状形态转变为排列规则的串珠样形态。
敲黑板啦！
1、线粒体可通过一种名为串珠化（Pearling）的可逆形态变化，从管状转变为规则的珠串结构。
2、该过程由内质网-线粒体接触位点介导的钙离子内流触发，并受线粒体嵴密度调控。
3、串珠化能将mtDNA核样体解聚，并使其以规则间距重新分布。
4、抑制钙信号或破坏嵴结构会导致核样体异常伸长和聚集，形成“Nucleotes”。
1、线粒体串珠化是一种生理性的、可逆的生物物理不稳定性。
线粒体串珠化现象通常是在膜破裂、钙离子载体处理或缺乏分裂功能的线粒体过度伸长的情况下被诱导产生的。为了评估其在稳态条件下的相关性，研究员试图观察其在静止状态下的出现情况。自发形成的串珠化事件，即在细胞未受物理或药物诱导的情况下发生的事件，出现在未经处理的人类U2OS细胞中（图1A），在每秒1帧的宽场荧光成像下，其平均发生率为5.5±4.5个事件/细胞/分钟，通过矩阵标记进行测量，串珠状结构的平均直径为425±86 纳米（图1B、图1C）。串珠状结构的形成没有明显的亚细胞定位偏向（图S1A），每个事件的平均串珠状结构数量为8个，最多可达约50个（图S1B、图S1C和图S2A）。同一线粒体在一次采集过程中可能会多次形成串珠状结构，平均在恢复后约43±42秒后再次发生。因此，在对照的人U2OS细胞中，串珠状结构覆盖了总线粒体网络的平均9.4±4.8%（图1D），而在HeLa和小鼠胚胎成纤维细胞中分别为4.2±3.9%和12.4±4.6%。这实际上是一种低估的情况，因为可逆的串珠化过程往往难以捕捉——它们会在一帧画面到下一帧画面之间迅速出现、消失并恢复（即便是在高达每秒100帧的相位对比成像中也是如此），不过有时会持续长达60秒。
图1：生理性和可逆性的线粒体串珠现象。
与既往研究一致，线粒体串珠化有时会伴随膜电位闪烁（图S1D），其中约30%的情况下会导致线粒体在狭窄处发生分裂（影片S1），而其余大多数情况下则恢复为管状形态（图S1E）。可逆的线粒体串珠状结构在多种哺乳动物细胞类型以及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中均有出现（图S2A），其形态和动态变化相似。研究员通过多种标记策略检测到了可逆的串珠状结构，包括线粒体外膜（OMM）和基质靶向的荧光蛋白、基质和线粒体内膜（IMM）的活细胞染料以及无标记对比成像。研究员还使用了多种显微镜技术，包括宽场荧光显微镜、光片显微镜、阵列检测共聚焦显微镜、即时结构光照明（iSIM）显微镜和受激发射损耗（STED）显微镜（图1A、图1E、图1F、图S1D和图S2A）。为了获得最温和的成像条件，研究员使用相差显微镜观察串珠状结构（图S2A、图S2B）。该成像方法使研究员能够采用一种基于事件驱动的采集模式，即通过一个事件检测神经网络（小编注：神经网络是计算机名词，指是一种模仿生物神经网络（特别是大脑）的结构和功能的计算模型。这里特指基于深度学习的事件检测网络。该模型可在训练完成后，通过输入多个连续时间点的相差图像，利用动态信息判断事件是否发生）在实时相位对比图像中训练识别串珠事件，并在识别成功后触发荧光成像，从而避免了潜在的激光诱导或光毒性（图S3A）。这些观察结果表明，串珠状现象是一种生理性的、可逆的、频繁发生且在进化上具有保守性的线粒体动态形状转变，它会同时收缩外膜、内膜和基质（图1E）（小编注：PKMO用于标记线粒体内膜及嵴结构，是专门用于超分辨成像使用的线粒体染料，毒性低，与我们Hv1超分辨拍摄使用的PKMDR性质类似。其原理基于优化过的疏水结构使其在进入线粒体后更容易嵌入内膜的膜脂环境，而非水相的线粒体基质。相较而言，MitoTracker染料是带正电、疏水性的小分子。它们进入线粒体的富集与线粒体膜电位有关，而线粒体膜电位主要建立在IMM两侧，基质侧相对膜间隙侧更负。因此可认为Mitotrakcer主要富集在IMM的线粒体基质侧。但是MitoTracker并不能特异性结合IMM或线粒体基质，会存在显著泄露，因此针对线粒体基质，更好的方式是COX8A-MTS标记的基质靶向荧光蛋白。）。
研究者通过对 U2OS 细胞进行高压冷冻，使其尽可能保持接近天然状态，并利用电子显微镜捕捉到了更精细的串珠状超微结构。经过冷冻固定和随后的聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）成像后发现（图1G、图S4A），串珠状线粒体的内膜和外膜保持了对称性和连续性，即使在收缩处，线粒体基质也仍然保持联通。这些三维体积数据还使研究者能够观察内质网的存在情况，其与线粒体的接触可以触发串珠状现象并驱动收缩。尽管该数据集中，所有的串珠状线粒体都与内质网接触（接近距离小于32 nm），但仅有40%的串珠状收缩带被内质网管状结构包裹（图1H、图1I和图S4B）。在活细胞成像中，观察到的内质网接触和包裹率相似（图1I、图1J）。因此，内质网-线粒体接触位点（ERMCSs）似乎并非通过局部机械变形来强制形成串珠状结构，而是通过局部触发串珠化，随后通过相互连接的线粒体网络传播来实现的。为了验证这一假设，研究员沉默了先前与ERMCS信号传导相关的蛋白质：线粒体钙转运体（MCU）和倒置型成形素2（INF2）（小编注：倒置型成形素2，属于formin家族的肌动蛋白调控蛋白，主要功能是调控F-actin的聚合、延长和解聚）。这两种蛋白质的缺失均显著降低了串珠状结构的形成频率（图1K），同时并明显改变线粒体网络形态（图S5A、图S5E）。这表明生理性的线粒体串珠化是由ERMCS介导的钙内流触发的。
拓展阅读：ER-线粒体接触位点
ERMCS（内质网 - 线粒体膜接触位点）是无核糖体包裹的光面内质网与线粒体外膜相互贴近形成的纳米级膜连接结构，膜之间不发生融合，依靠跨膜蛋白复合物进行物质交换与信号交流，该接触区域的膜组分也被称作线粒体相关内质网膜。
ERMCS 的结构由多组分子支架共同维系，核心栓系复合物包含 IP3R-GRP75-VDAC1、VAPB-PTPIP51、FIS1-BAP31、MFN1-MFN2 以及 VAPB-MIGA2 等；线粒体外膜上的PACS2可调控IP3R-GRP75-VDAC1复合体稳定性，内质网Sig-1R、BiP与IRE1α协同调控IP3R钙通道活性，而ER膜上的VMP1能够调控SERCA钙泵，进一步稳定接触位点结构。
钙信号转运是ERMCS最核心的功能：内质网释放的钙离子在膜间隙内定向转运，经IP3R、GRP75与VDAC1跨膜传递后，由线粒体内膜MCU摄取进入基质后调控线粒体代谢稳态。ERMCS同时串联线粒体动力学过程，MFN2、MIGA2、Miro等线粒体融合相关蛋白可促进 ERMCS 组装，其中Miro依靠 VPS13D与VAP 建立膜连接，MIGA2还能在接触位点介导脂滴形成。
线粒体分裂起始严格依赖ERMCS：内质网小管在接触位点缠绕并挤压线粒体膜，预先划定分裂位置，同时RAB7阳性晚期内体参与形成线粒体、内质网与内体三者的连接结构，PDZD8-FKBP8分子桥稳定三方接触，协同招募DRP1、FIS1与MFF完成膜切割。除此之外，ERMCS还接收COPI囊泡逆向运输信号，保障膜脂质转运，实现内质网与线粒体间脂质分子交换。当 ERMCS 结构被破坏时，钙转运通路中断，线粒体融合与分裂失衡，细胞器互作紊乱，最终打破细胞稳态，成为多种疾病发生的重要诱因。
参考文献：
[1] Liu SH et al., Cell Commun Signal. 2026 Mar 27;24(1):271.
从物理角度来看，只要其抵抗变形的弹力超过膜张力，管状膜就会保持稳定状态，否则它会通过类似性瑞利-帕洛特不稳定性（Rayleigh–Plateau instability）的过程发生周期性起伏，并转变为类似“串珠”的形态。线粒体的弹性源于外膜和内膜的弯曲以及嵴的折叠，而研究员通过FIB-SEM和STED所获得的数据通常显示，串珠状线粒体中的嵴密度较低（图1F、图1G）。因此，研究员想知道调节嵴密度是否会影响串珠现象的出现和稳定性。在HeLa细胞中，去除线粒体接触位点和嵴组织系统的核心亚基MIC10会减少层状嵴的形成，但对呼吸链的组装仅有轻微至可忽略不计的影响，同时仍保留了管状形态（图S6A、图S6B）。在HeLa细胞中，通过siMIC10技术敲低MIC10会增加串珠现象的发生概率，与小干扰RNA（siRNA）对照组相比（图1L、图1M），这反映在串珠现象的发生频率（串珠现象的频率）和瞬时串珠形成率（从17±4%到50±11%的细胞）上。尽管在MIC10缺陷细胞中IMM-OMM的连接会减弱，但siMIC10细胞中的两个膜仍同时发生串珠化（图S6C）。此外，在siMIC10细胞中，持续时间超过整个6分钟采集时间的持续事件相当普遍（图1L）。因此，线粒体的串珠状结构变化是一种常见且可迅速恢复的形态转变，其发生频率和恢复情况受到内质网来源的钙离子流入与板层状嵴凹陷密度之间相互作用的调节（图1N）。
图S1 自发性线粒体串珠化的时空特征与可逆性
图S2 可逆性线粒体串珠化在不同细胞类型和物种中的保守性
图S3 相差触发的事件驱动成像验证串珠化的生理性
图S4 线粒体串珠化的三维超微结构及核样体定位特征
图S5 MCU和INF2缺失降低串珠化频率但不破坏线粒体网络形态
图S6 MIC10缺失导致层状嵴减少并增强线粒体串珠化
2、串珠蛋白能包裹住线粒体DNA核样体
正如瑞利-普拉托型不稳定现象的典型表现那样，线粒体串珠化呈现出具有特定波长的波动；在此情况下，其波长为0.81±0.13μm，这是通过STED显微镜测量得出的（图2A、图S7A）。这个距离与U2OS细胞中线粒体三维网络中mtDNA核样体的中位间距几乎完全相同（分别为0.84±0.13μm和0.79±0.43μm；图2B、图S7B）（小编注：文章中作者先用STED/iSIM测量串珠化线粒体中相邻珠子之间的中心距离，发现约为0.8μm。随后，他们用SYBR Gold染色标记mtDNA核样体，并沿线粒体轴线提取核样体荧光峰，计算相邻核样体峰之间的距离，发现核样体间距也约为0.8μm。由于二者尺度高度一致，作者进一步用每条线粒体的长度和核样体数量建立等距与随机分布模型，发现实验结果更接近等距分布。），也与酵母中的已发表值（0.8μm）一致。利用每个线粒体的三维长度和核样体数量，研究员模拟了核样体分布的两种极限模型：一种是假设核样体完全等距分布，另一种是假设核样体随机分布。在每个线粒体中将核样体等距排列（图2C），结果表明核样体之间的中位距离与实验值（0.81±0.31μm）以及串珠之间的距离均无显著差异。因此，核样体间距似乎由一种依赖线粒体长度的机制维持，而这种机制的精确性可能受到其离散化特征的限制。这促使研究员研究串珠现象与核样体之间的关系。
图2：串珠驱动的线粒体DNA重新分布
对核样体和线粒体（IMM或基质）进行双色成像显示，83±3%的串珠中都存在核样体，且核样体位于其中心附近（图2D、图2E和影片S2）（2E怎么解读？）（答：上方的2E是很多单个串珠的连线叠加，每一个串珠都沿轴线切一条线并叠加在一起，看mtDNA peak是否集中在串珠中心。下方2E是在定量说明在含有核样体的串珠中，核样体峰值多数位于串珠的中心区域，其中绿色区域代表平均的串珠形态，紫色的点代表TFAM-RFP信号峰值位置。）。串珠也可能在没有核样体的情况下出现（图2F、图S7C）。此外，通过48小时的溴化乙锭处理急性耗尽mtDNA，并不影响线粒体的形态或串珠形成频率（图2G、图2H和图S7D-F）。因此，核样体并不决定串珠的出现或形状。
研究员推测情况可能恰恰相反——串珠可能控制着核样体的位置。研究员在没有诱导的情况下评估了线粒体串珠事件发生前、发生时和发生后的核样体组织情况。与串珠形成前在iSIM中有时呈现的分散或不规则外观（串珠前期）不同，串珠内的核样体呈现出清晰的点状结构（图2I、图2J），其间距与群体平均值一致。为了排除染料嵌入、膜电位依赖性或蛋白过表达可能造成的影响，研究员使用基因编码的（mt-StayGold和TFAM-RFP）（小编注：mt-StayGold 和TFAM-RFP是一组基因编码荧光标记工具，用来替代或验证小分子染料成像结果。mt-StayGold是线粒体靶向的绿色荧光蛋白，通过将改造的耐漂白绿色荧光蛋白StayGold接上线粒体靶向序列，从而用于标记线粒体。TFAM-RFP的用途则是标记包含mtDNA的核样体，并观察串珠化过程中核样体是否被重新分隔、解聚和均匀排列。这里的TFAM是哺乳动物mtDNA核样体的核心包装蛋白之一。mtDNA通过与TFAM等蛋白结合，形成核样体。因此，把TFAM与RFP融合后，TFAM-RFP会定位到 mtDNA核样体上，从而用红色荧光显示核样体位置）和染料基探针（SYBR Gold和MitoTracker Red FM）来重复这些结果。在所有情况下，串珠形成的过程都会重塑并重新分布核样体，从而形成更清晰且间距更均匀的聚集点。
研究员还在更温和的宽场成像条件下评估了串珠化驱动的核样体重新分布。尽管核样体间距分布通常并非随机的，但串珠形成过程导致的分布相较于串珠形成前更为狭窄（图2K、图2L），且在线粒体恢复成管状结构后仍保持狭窄状态。串珠形成和恢复之后，使用TFAM-RFP或SYBR Gold核样体标记观察时，每次事件的平均核间距离显著减小（图2K），并接近全细胞水平预期的中位值（约840 nm）。研究员认为平均核间距离的减少可能是由于较大核样体的解聚所致，这一点在后续章节中进一步进行了研究。
为了研究核样体运动对空间分布的影响，研究员基于一个模型进行了模拟，该模型假设在串珠形成后，核样体会继续扩散，直到下一次串珠化事件发生。研究员在一个10 μm×400 nm的管状容器内，以810 nm的等间距间隔放置核样体，以模拟串珠形成后的线粒体（图S8A、图S8B）。研究员利用测量得到的瞬时核样体位位移模拟了二维随机运动。为了考虑成像分辨率和核样体聚集的影响，将彼此距离小于50 nm的核样体合并处理。核样体之间的距离分布以及每次模拟的中位数均再现了实验分布（图2M、图2N），其中实验中串珠化后的核样体间距分布是在模拟40 s后获得的，而串珠化前那种非随机的核样体间距分布在3.3分钟后（与实验分布的最小柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫D统计量相比）得以重现（图2M）。
研究员指出，既往报道的核样体位移可能被高估，因为它们是相对于细胞而非线粒体测量的，而线粒体本身也在移动。因此，研究员假设估计值代表了预测时间的下限。在对照条件下，平均而言，总线粒体网络长度中有9.4%的部分至少在一分钟内发生过一次串珠状变化，并且频繁地多次发生（47%的情况，次数在1到9次之间；图1A）。假设所有线粒体出现串珠化的概率相同（图S1A），那么在这3.3分钟内，线粒体网络中约37%的部分会串珠化；而在10分钟内，超过75%的线粒体网络至少会串珠化一次。这些估计表明，线粒体内的扩散和核样体融合能够解释实验中的串珠化后和串珠化前的分布情况，并且实际发生的串珠化频率也足以维持线粒体网络中核样体之间的分离状态。
线粒体RNA团块（MRGs）是存在于基质中的RNA-蛋白质凝聚物，其形态与核样体相似，但分布并不规律（小编注：MRGs是位于线粒体基质内的、富含mtRNA和RNA结合蛋白的小型无膜亚结构。主要负责调控线粒体的mtRNA，包括将mtDNA转录出的RNA加工成成熟的mRNA或rRNA、非编码或错误mtRNA的处理等，同时也参与线粒体核糖体的组装，负责将12s rRNA和16s rRNA和核糖体蛋白组装成核糖体小亚基和大亚基。）。尽管串珠化会影响它们的位置，就像对核样体的影响一样，但它们稀少的丰度使得它们不太可能在相邻的串珠中占据位置，因此会导致出现没有MRG的串珠结构（图S9A、图S9B）。研究员推测，由于核样体数量和串珠数量成比例，这使得串珠化能够有效地规范mtDNA的分布，而较低的核样体移动性则维持了这种间距。
图S7 串珠间距与 mtDNA 核样体间距的定量对应关系
图S8 核样体扩散模拟解释串珠化前后间距分布变化
图S9 串珠化驱动核样体解聚并影响线粒体 RNA 颗粒定位
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