代谢学人
Cell Metabolism：脂肪动起来，线粒体重生
撰文 | 李姿萱 郭钰涵 周文豪 邱瑾
编辑 | 孟美瑶
校对 | 李姿萱
背景介绍线粒体是新陈代谢、生物合成和信号传导的核心场所，即使发生轻度损伤也会对细胞造成不良后果。目前，已知400多个突变基因与原发性线粒体疾病有关，总发病率为1：2000-1：5000。此外，帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、糖尿病和阿尔茨海默病均表现出继发性线粒体功能障碍的特征，探究细胞如何适应并克服线粒体应激对于治疗这些疾病具有重要意义。在应激条件下恢复线粒体功能的反应通路是当前研究的热点领域。先前，研究人员发现酿酒酵母中线粒体DNA（mtDNA）的缺失会引发线粒体逆向信号传导通路，调控核基因表达，从而恢复细胞代谢功能并延长细胞寿命。此后，在哺乳动物细胞和秀丽隐杆线虫中进一步阐明了细胞内和细胞间线粒体未折叠蛋白反应过程中发生的信号通路和基因表达变化。除了基因表达调控，细胞还能通过引发线粒体碎片化或应激诱导的线粒体过度融合（hyperfusion）、伸长等形态变化来应对线粒体应激，从而增强细胞对应激条件的抗性。
尽管上述研究让我们加深了对线粒体应激相关反应的理解，但它们通常采用单一且极端的模型，忽视了在应激过程中发生的细微而重要的反应，此外，目前对应激恢复的研究主要聚焦于蛋白质和基因的变化，而对脂质及其代谢产物在其中发挥的作用研究较少。近期，一篇发表在Nature Cell Biology上的题目为“Triacylglycerol mobilization underpins mitochondrial stress recovery”的文章发现，三酰甘油（TAG）的分解动员在线粒体应激恢复的过程中发挥重要作用，并且这种动员依赖于TAG脂肪酶（Tgl3-5p）释放脂酰基而合成心磷脂，从而促进了应激后线粒体的功能恢复。
敲黑板啦！
1. TAG动员释放的酰基用于心磷脂的生物合成，从而支持线粒体的生物发生
2. 脂滴来源的TAG动员在线粒体应激恢复中发挥重要作用
3. TAG脂肪酶Tgl3-5p驱动的脂解是酵母细胞在线粒体应激后TAG动员的主要途径
4. 哺乳动物细胞也需要TAG动员来克服线粒体应激
研究结果
1、线粒体应激和恢复的多组学分析
为了探究酿酒酵母如何响应线粒体应激，研究人员对14株酵母菌（2株野生型WT，12株实验组）进行了多组学质谱分析。研究人员利用CRISPR-Cas9 技术在目标基因中引入破坏性点突变，目标基因包括线粒体必需基因（ssc1, hsp10, mas1） 、线粒体呼吸相关基因（mrpl34, rrf1, mrh4）、调控线粒体蛋白稳态的基因（cox4, mDhfr），此外，研究人员还使用抑制线粒体翻译的药物（多西环素 DOX和氯霉素CAM）对菌株进行处理。二甲基亚砜（DMSO）处理的WT作为溶剂对照（WTV）。
研究人员将所有菌株接种在YPG呼吸培养基（小编注：YPG培养基是一种常用的酵母菌培养基，其成分主要包括酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖）中培养24小时，结果发现在早期时间点时，基因突变或药物处理的菌株均出现了生长延迟现象，因此研究人员在不同时间点收集菌株，当WT菌株的OD值达到E点时收集WT菌株，对于生长较慢的基因突变或药物处理的菌株，则在L点达到与WT相同的OD值时收集（图1a）。
其中，Group1菌株生长较快（图1b和扩展数据图1a,e），仅在E时间点取样，其余菌株中，Group2的三株有轻微生长延迟（扩展数据图1b），Group3的三株有严重生长延迟（扩展数据图1c），二者均在L时间点取样（图1c），Group4的菌株（ssc1，扩展数据图1d）生长过慢（无法生长至与WT组相同OD值的L点），仅在E时间点取样。研究人员使用液相色谱-质谱 （LC-MS） 技术分析所有样本，该技术可同时从单一样本中提取蛋白质、脂质和极性代谢物，最终共定量分析了4489种蛋白质、2713种脂质（其中308种已被鉴定）和1578种代谢物（其中112种已被鉴定）（图1d，扩展数据图1f）。研究人员通过层次聚类分析将E时间点收集的12株实验组菌株分为四个分支（图1e），值得注意的是，Group3菌株在E时间点线粒体和氧化磷酸化（OXPHOS）蛋白丰度降低，然而，在之后的恢复期（小编注：文中使用了E和L两个时间点，这里指的应该是恢复后期，即L时间点），线粒体DNA （mtDNA）和OXPHOS水平均增加（图1f–h，扩展数据图1g–j），这说明线粒体的生物发生增加。此外，Group4的ssc1菌株在E时间点也表现出类似的线粒体受损（扩展数据图1k），但ssc1菌株却未能恢复，说明ssc1菌株可能无法激活关键的恢复通路。此外，在这些实验组菌株中，与恢复相关的典型逆向应激反应通路标志物（如Cit2p, Pdh1p）均未被诱导表达（扩展数据图1m,n）。综上所述，这些数据表明，Group3菌株具有与目前已知通路不同的应对线粒体应激的反应机制（小编注：目前关于线粒体应激及恢复期的线粒体数量、质量\mtDNA\线粒体蛋白的变化，可能受到应激源类型，应激时间长短，以及特定组织或细胞而具有不同的表现形式。但总体来讲，无论是酵母和哺乳动物细胞，在应激期通常会表现出线粒体受损，功能下降，线粒体膜电位及氧化磷酸化水平降低；而在恢复期则可通过线粒体自噬清除受损线粒体，以及线粒体生物发生，以恢复线粒体功能。参考文献：1. Zhao L, Zou X, Deng J, et al. hnRNPH1 maintains mitochondrial homeostasis by establishing NRF1/DRP1 retrograde signaling under mitochondrial stress. Cell Death Differ. 2025）；2. Singh G, Vengayil V, Khanna A, Adhikary S, Laxman S. Active control of mitochondrial network morphology by metabolism-driven redox state. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025）；3. Walker EM, Pearson GL, Lawlor N, et al. Retrograde mitochondrial signaling governs the identity and maturity of metabolic tissues. Science. 2025）。
图1. 多组学数据筛选确定克服线粒体功能障碍的菌株
扩展数据图1. 多组学数据筛选确定克服线粒体功能障碍的菌株
2、TAG衍生的心磷脂的产生与线粒体的应激恢复相吻合
为了探究Group3（DOX、rrf1、hsp10）线粒体应激恢复相关的通路，研究人员对Group3与Group4进行多组学分析来寻找二者的关键分子变化。结果发现，二者最显著的差异在于Group3 菌株的三酰甘油（TAG）种类显著减少，而在Group4菌株没有观察到这种现象（图2a）。并且TAG丰度的下降并未伴随其他脂质类别的明显变化（扩展数据图2a-d）。除少数低饱和度TAG 种类略有增加外，无论链长和饱和度如何，大多TAG丰度均下降（扩展数据图 2e–g）。BODIPY 染色（图2b，扩展数据图2h）和尼罗红荧光检测（图2c，扩展数据图2i）均验证了这一现象（小编注：BODIPY和尼罗红均可标记胞内中性脂质）。
为了探究上述TAG水平降低是由于TAG合成减少还是TAG动员的增加，研究人员进行了同位素标记实验，用[13C1]标记的油酸培养菌株1h，再对菌株进行长期DOX处理，以追踪新合成的TAG。结果显示，尽管DOX处理的酵母中未标记的TAG总量明显减少（图2d），但它们能迅速利用[13C1]油酸合成新的重标TAG（图2e）。这表明Group3 菌株的TAG减少可能是由于TAG动员增强所致，释放的酰基链可能被用于合成其他脂质。
为追踪这些酰基链的去向，研究人员设计了另一项标记实验：先用[13C1]油酸处理WT细胞1小时，再进行急性3小时的DOX或对照溶剂处理（图2f，g）。重标油酸有效标记了TAG和磷脂（扩展数据图2j-m），DOX处理组细胞中新合成的重标心磷脂水平显著高于溶剂对照组（图2f，g）。相比之下，重标磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）则无明显变化（图2g）。这表明，线粒体应激后，TAG分解后的酰基会优先用于心磷脂的生物合成，从而用于线粒体的生物合成。这与多组学筛选结果一致：L时间点Group3 菌株线粒体蛋白丰度回升（图1g），并且四种最主要的酵母心磷脂种类也显著增加，甚至有的种类超过了WT组心磷脂水平（图2h）。
线粒体中心磷脂的合成完全在线粒体内进行。为了探究阻断此合成途径是否会影响线粒体功能的恢复，研究人员构建了缺失心磷脂合酶Crd1p的酵母突变体 （crd1Δ），并检测其在DOX处理下的生长情况。结果显示，crd1Δ组无论是否经DOX处理，细胞中的心磷脂含量几乎为0（图2i，扩展数据图2n）。同时，心磷脂前体磷脂酰甘油（PG）的丰度增加（扩展数据图 2n）。尽管crd1Δ 菌株表现出轻微生长缺陷（图2j），PG的增加可能会维持其呼吸和生长能力（小编注：一方面，PG是酵母呼吸链复合体的关键辅因子，PG能与细胞色素c氧化酶（ComplexIV）结合，维持线粒体呼吸。另一方面，PG是心磷脂的前体，PG增加能增加心磷脂含量，间接促进线粒体呼吸），但并不能使crd1Δ 菌株像WT组一样经DOX处理后还能有效恢复（图 2k）。这些数据进一步证实了心磷脂是线粒体应激恢复所必需的，同时，crd1Δ酵母在DOX处理后没有发生TAG动员（图2l），进一步说明TAG动员对线粒体应激恢复非常重要。
拓展阅读
TAG与心磷脂合成
首先，TAG在脂肪酶的作用下水解生成二酰基甘油DAG，释放R₃脂肪酸，之后DAG再由二酰基甘油激酶（DGK）磷酸化生成心磷脂从头合成的底物PA。在这个过程中，酰基被活化。
TAG分解为PA的反应式
心磷脂合成主要依赖CDP-二酰基甘油（CDP-DAG）途径，关键步骤如下：
(1)PA与CTP在CDP-DAG合成酶（CDS1/CDS2）催化下生成CDP-DAG，释放焦磷酸（PPi）
(2)CDP-DAG与甘油-3-磷酸（G3P）在PGP合成酶（PGS1）作用下生成磷脂酰甘油磷酸（PG-P）
(3)PGP被PGP磷酸酶（如PPGP1）去磷酸化，形成磷脂酰甘油（PG）
(4) PG与另一分子CDP-DAG在心磷脂合成酶（CLS，位于线粒体内膜）催化下缩合，生成心磷脂，释放CMP。
心磷脂的从头合成
心磷脂促进线粒体生物合成的机制：
心磷脂 （CL） 是一种在线粒体内膜中合成的线粒体独有磷脂。CL在线粒体膜中起着关键作用，影响线粒体的融合和分裂，进而影响线粒体的构和功能。 CL通过介导线粒体融合（哺乳动物中的Opa1和酵母中的Mgm1）的动力蛋白相关GTP酶的生物发生和组装，在线粒体内膜的融合中发挥重要作用。最近的一项研究还表明，CL通过与Opa1 的相互作用直接参与膜融合。除了在内膜融合中发挥作用外，Opa1/Mgm1 还促进外膜融合，这可能是通过与外膜蛋白（如哺乳动物的 mitofusin 和酵母中的 Fzo1和Ugo1）的相互作用来实现的。
在内膜 （IM） 中，CL 刺激和介导 Opa1 介导的融合
CL也存在于外膜中，并调节由另一种动力蛋白相关GTP酶Drp1介导的线粒体分裂。Drp1是一种胞质蛋白，通过与整合外膜蛋白（如Mff、Mid49、Mid51和Fis1）相互作用而被募集到线粒体中。Drp1虽然缺乏已知的脂质结合结构域，但能与CL结合。目前，外膜中的CL已被证明可以诱导Drp1的寡聚化，最终促进线粒体分裂。
参考文献：
[1] Kameoka S, Adachi Y, Okamoto K, Iijima M, Sesaki H. Phosphatidic Acid and Cardiolipin Coordinate Mitochondrial Dynamics. Trends Cell Biol. 2018
[2] Fuentes JM, Morcillo P. The Role of Cardiolipin in Mitochondrial Function and Neurodegenerative Diseases. Cells. 2024
[3] Francy CA, Alvarez FJ, Zhou L, Ramachandran R, Mears JA. The mechanoenzymatic core of dynamin-related protein 1 comprises the minimal machinery required for membrane constriction. J Biol Chem. 2015
图2. 线粒体应激恢复的酵母菌株调动TAG动员以促进心磷脂的生物合成
扩展数据图2. 线粒体应激恢复的酵母菌株调动TAG动员以促进心磷脂的生物合成
3、脂滴为应激适应提供TAG
基于上述的脂质谱变化，研究人员利用共聚焦显微镜观察了DOX处理后酵母细胞器的变化，结果显示，与多组学数据相吻合，DOX处理的酵母在恢复早期（E时间点），其线粒体体积偏低，而在恢复后期（L时间点）线粒体体积有所回升（图3a–c）。相比之下，内质网在所有时间点均呈现接近正态的分布（图3d，e）。值得注意的是，脂滴体积的变化趋势与线粒体的体积变化相似（图3f，g），这进一步支持了脂质动员在应激恢复中的作用，表明脂滴正是被消耗的TAG的来源。
基于此发现，研究人员重新分析了蛋白质组学数据，对所有定量的蛋白质、脂质及其代谢物进行了相关性分析，以筛选受线粒体应激影响最大的TAG相关的蛋白质（图3h）。结果显示，脂滴蛋白Pln1p（也称Pet10p）与所有检测出的不同类别的TAG水平显著正相关（扩展数据图3a-c）。Pln1p是一种脂滴包被蛋白（perilipin），定位于新生脂滴表面，参与TAG的生物发生，但其在TAG动员中的作用尚不明确。鉴于其与TAG水平的正相关性，研究人员推测过表达PLN1可能会干扰线粒体应激下的TAG分解代谢，实验证实，过表达PLN1确实能抑制DOX处理后的TAG减少，并导致TAG种类整体增加（图3i，j，扩展数据图3d）。
为了探究PLN1过表达对TAG分解代谢的影响，研究人员进行了[13C1]油酸示踪实验（图3k）。如前文相似，将酵母置于呼吸培养基中培养，用[13C1]油酸脉冲标记1小时后，测定新合成的重标[13C1]三油酸甘油酯的丰度（图3k）。结果显示，PLN1过表达对重标TAG的初始合成速率影响不大（图3l）。脉冲标记后，研究人员加入浅蓝菌素（cerulenin）（一种强效TAG合成抑制剂）和DOX以诱导TAG动员，并在1、3、5 小时后取样，追踪重标三油酸甘油酯的消耗速率（图3k）。结果显示，截至3小时，对照组酵母的重标TAG水平已显著低于PLN1过表达株；截至5小时，差异显著增大（图 3m）。相应地，丧失TAG动员能力的PLN1过表达株在DOX处理的呼吸培养基中表现出明显的生长缺陷（图 3n，扩展数据图3e，f）。这些数据说明了脂滴来源的TAG动员对线粒体应激恢复具有关键作用，而这一过程能够被PLN1所调控。
图3. 脂滴与线粒体应激恢复有关
扩展数据图3. Pln1p在TAG动员和线粒体应激恢复中发挥作用
4、有效的应激恢复需要TAG动员
接下来，研究人员进一步探究了酰基链的释放机制，酵母中TAG分解代谢主要有两条途径（图4a）。一是脂解（lipolysis）：由TAG脂肪酶Tgl3-5p介导，在脂滴表面逐步水解TAG。二是脂噬（lipophagy）：脂滴被液泡（vacuole）吞噬并快速降解，脂噬过程依赖于脂滴-液泡接触位点蛋白Ldo（Ldo45/16p）及核心自噬蛋白（如Atg14p、Atg15p和Atg1p）。为了确定TAG减少的机制，研究人员分别构建了缺失脂解和脂噬通路的酵母突变体：tg13Δtgl4Δtgl5Δ（tg1ΔΔΔ）代表脂解缺陷，ldo45Δldo16Δ （ldoΔΔ） 和atg14Δ代表脂噬缺陷。随后研究人员对这些菌株进行急性3小时DOX处理以观察TAG动员。尼罗红荧光（图4b）和LC-MS/MS（图4c）分析显示，DOX处理后，WT细胞的TAG水平下降，在三种缺失株中，只有tg1ΔΔΔ 突变体在DOX处理后维持了TAG水平，而ldoΔΔ、atg14Δ和其他典型脂噬突变体菌株如atg1Δ和atg15Δ 都表现出与WT相当的TAG下降（图4b，d，扩展数据图4a-e）。这些数据一致表明，Tgl3-5p驱动的脂解是酵母细胞应对此类线粒体应激时TAG动员的主要途径。
为了进一步探究脂解在线粒体应激恢复中的作用，研究人员比较了WT和tg1ΔΔΔ突变体从长期DOX处理中恢复的能力，即测定两种菌株经DOX处理后在E时间点（24h）和L时间点（48h）的生长情况，结果发现，两株菌株在DOX处理24小时后均表现出严重生长缺陷。然而，tg1ΔΔΔ突变株在后期无法恢复生长（图5a）。有趣的是，缺失主要TAG合成酶二酰甘油酰基转移酶（dga1Δ）的酵母和缺失所有中性脂质合成酶的四重敲除株（dga1Δlro1Δare1Δare2Δ（ΔΔΔΔ））均无法恢复生长（图5a，扩展数据图5a–c）。这进一步证明了TAG的生物合成和TAG动员在克服线粒体应激中的核心作用。
上述结果表明，TAG动员是细胞从线粒体应激中恢复的关键，并且这是通过促进心磷脂的合成而实现的。然而，TAG脂解的另一潜在作用是为脂肪酸β-氧化（FAO）提供底物。为了验证这一猜想，研究人员通过敲除脂酰辅酶A氧化酶基因POX1，构建了FAO缺陷株 （pox1Δ）。该菌株在处理前就显示出较高的基础TAG水平（扩展数据图5e），但在DOX处理后仍能有效恢复并动员TAG（图5a，扩展数据图5d）。这表明应激恢复与FAO无关。与此结论一致，与WT相比，尽管tg1ΔΔΔ酵母在长期DOX处理后的mtDNA水平与WT酵母相当，但tg1ΔΔΔ酵母的心磷脂水平和线粒体蛋白的丰度并没有增加（小编注：作者在讨论部分进行了相关解释如下：心磷脂可以用来提供线粒体快速膜扩张所需的脂质，类似于自噬体形成。而缺乏这种能力的菌株可能缺乏线粒体蛋白表达所需的空间，导致无法挽救我们在tglΔΔΔ菌株中观察到的线粒体蛋白丰度，即使它们保持mtDNA的WT水平）（图5b–g，扩展数据图 5f）。此外，补充足够量用于标记TAG的[13C1]油酸也无法恢复其生长（扩展数据图5g，h）。这些数据共同证明，TAG动员，特别是通过Tgl3-5p介导的脂解途径，对于克服DOX诱导的线粒体应激是不可或缺的
图4. 线粒体应激期间的TAG动员需要tgl脂肪酶
图5. TGL依赖的TAG动员对于酵母克服线粒体应激是必不可少的
扩展数据图4. 线粒体应激期间的TAG动员需要tgl脂肪酶
扩展数据图5. TGL依赖的TAG动员对于酵母克服线粒体应激是必不可少的
5、TAG动员也能够驱动哺乳动物细胞的应激恢复
为了探究TAG动员来恢复线粒体功能是否也适用于哺乳动物，研究人员将HAP1细胞（人慢性粒白血病细胞）培养在葡萄糖基础培养基中培养24小时，然后换入半乳糖培养基中（在此条件下细胞存活依赖线粒体呼吸）（小编注：癌细胞正常情况下主要依靠糖酵解供能维持细胞快速增殖生长；而半乳糖代谢为G6P的速率极低，会导致糖酵解ATP产量不足，迫使细胞代谢转向依赖线粒体氧化磷酸化供能），并用DOX处理6天。结果发现，DOX处理的HAP1细胞在转换至半乳糖培养基后表现出明显的生长迟缓，但最终能够恢复（图6a），与Group3酵母的表型一致。研究人员分别在恢复前期（第2天）和恢复后期（第4天）收集细胞进行分析。结果显示，与酵母不同，DOX处理的HAP1细胞并未出现线粒体蛋白的全部丢失，而核DNA和 mtDNA 编码的OXPHOS蛋白水平降低（扩展数据图6a）。与酵母类似，这些线粒体蛋白的丰度能够随时间推移逐渐恢复（图6b）。
为了探究在此恢复过程中TAG动员的情况，研究人员对半乳糖培养基培养期间的细胞进行了非靶向脂质组学分析。结果显示，虽然DOX处理组在第2天TAG丰度较高（扩展数据图6b），但在第2天至第5天期间，TAG被持续消耗（图 6c）。研究人员在HAP1细胞中敲除了与酵母TGL基因功能相同的ATGL，结果显示，DOX处理的ATGLKO细胞在第5天时TAG丰度显著高于对照组（图6d），这表明ATGL至少部分参与了TAG动员。值得注意的是，ATGL敲除与DOX联合处理呈现致死效应（图6e，g），这进一步验证了TAG动员在哺乳动物细胞克服线粒体应激中的重要性。另外，研究人员敲除了FAO必需酶——肉碱棕榈酰转移酶II（CPT2），发现在DOX处理下并未引起明显的生长缺陷，说明TAG动员释放的酰基似乎没有被FAO所消耗，这与酵母模型是一致的（图6f，g）。这些数据证实，TAG动员机制在酵母和哺乳动物细胞中都存在，是应对线粒体应激恢复的关键环节。
图6. TAG动员是哺乳动物细胞克服线粒体应激所必需的
扩展数据图6. TAG动员是哺乳动物细胞克服线粒体应激所必需的
总结
本文以酵母和哺乳动物细胞为研究对象，在线粒体应激条件下进行了多组学分析，阐明了三酰甘油（TAG）的动员是线粒体应激恢复的关键环节。TAG来源于脂滴且TAG动员依赖于TAG脂肪酶（Tgl3-5p）释放脂酰基而合成心磷脂，从而促进了应激后线粒体的功能恢复和线粒体的生物生成。本研究表明，针对线粒体功能和脂质可用性的组合疗法可为治疗线粒体疾病提供新的参考。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41556-024-01586-6
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