编译：橙，编辑：小菌菌、江舜尧。

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作者从我国东部三个农业产区采集了施用有机肥和无机肥的稻田土壤，用作有机肥的猪粪来自附近的农场。利用GeoChip分析了MDRG和MRG的多样性特征，对细菌16S rRNA基因进行高通量测序，并通过qPCR对典型抗性基因进行了定量分析。

1 施肥土壤中抗生素和金属浓度以及MDRG和MRG多样性的比较

在粪肥中四环素类抗生素的浓度最高（平均6.7-20.1 mg/kg，p<0.05）。在施用有机肥的土壤中检测到较高浓度的土霉素、磺胺甲基嘧啶和恩诺沙星。在施用无机肥的土壤中未检测到目标抗生素，该结果可能受限于抗生素分析类型范围和定量抗生素方法的检测限。用作饲料添加剂的锌和铜的浓度在粪肥中最高（平均浓度分别为475-2183和349-771 mg/kg），在施有机肥和无机肥的土壤中浓度相似。

利用GeoChip5.0分析土壤和粪肥中MDRGs和MRGs的多样性。总共与9个MDRG基因家族相关的9919个独特探针进行了杂交，包括针对多种抗生素抗性（mfs、mex、abc、mate和smr）的5种多重耐药外排泵基因家族和4种β-内酰胺酶抗性基因家族。在施用无机肥的土壤中平均杂交5652个探针，在施用有机肥的土壤中杂交5970个探针。MDRGs的多样性与细菌多样性显著相关。以与多种抗生素耐药性相关的多重耐药外排泵基因为主，共有9,434个探针，此结果可能部分由于GeoChip上设计的探针信号不同。施用有机肥和无机肥的稻田土壤中的基因丰度响应比在0.21至0.29之间，表明施用有机肥的土壤中含有更高丰度的MDRGs。例如，在施用有机肥的土壤中，β-内酰胺酶抗性基因blaC和blaA的丰度（响应比分别为0.29和0.24）显著高于无机肥料的土壤。另外，总共检测到25,312个与101个MRG家族相关的独特探针，在施用无机肥和有机肥的土壤中平均分别杂交11,659和12,521个探针。与MDRGs相似，MRG多样性与细菌多样性也显著相关。粪肥施用显著增加了MRG的丰度，平均响应比为0.26。

冗余分析表明环境变量、施肥、土壤细菌群落和MRG多样性解释了土壤MDRG多样性中超过60％的变化。环境变量和施肥是主要因素。CCA分析表明这些非生物和生物因子对土壤MDRG和MRG多样性的造成了相似影响。年均温、土壤pH、总有机碳、全钾、总磷、锌、铜、铅、镍、铬、磺胺类和喹诺酮类抗生素以及粪肥中的MDRG和MRG多样性是影响土壤MDRG和MRG结构的重要因素。

2 粪肥施用后土壤中MDRGs、MRGs与潜在细菌宿主的共存增加

对抗性基因和细菌进行网络分析，以进一步研究抗性基因的潜在宿主信息。抗性基因和细菌的类似的丰度趋势可能一定程度上是由特定细菌宿主携带特异性抗性基因引起的。通过构建MDRGs、MRGs和细菌的共现网络，揭示MDRGs和MRGs的共选择潜力，识别共存抗性的潜在宿主（图1）。以多重耐药外排泵基因为主，常与As、Cd、Cr、Cu、Hg、Ni和Te的抗性基因共现，特别是MRG-Ni（图1）。在施用有机肥的土壤中，细菌和MDRGs之间的连接数比在施用无机肥的土壤中高，分别为262和223。细菌和MRGs之间的联系在施用有机肥的土壤中比在施用无机肥的土壤中更为普遍。MDRGs和MRGs主要与Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes共存。Actinobacterium WWH12、Bacillus、Geobacter、Solirubrobacter、Acidobacteriales、Bacillales、Chloroflexi、Methyloligellaceae和Xanthobacteraceae等抗性细菌是MDRGs和MRGs的潜在共同宿主。与施用无机肥的土壤相比，施用有机肥的土壤不仅增加了抗性基因共存的潜在宿主数量，而且增加了其丰度。而且，这些潜在的共同宿主与不同的MDRGs和MRGs（例如mfs、mex、abc、blaD、nikA、arsB、czcD、copA、cutA、znuC、terD、mer和psaA_5f0_Mn）的连接要比在施用无机肥的土壤中多。这些结果表明，施用有机肥增加了潜在的宿主细菌并增强了它们与MDRGs和MRGs的共存。

图1 多重耐药性基因（MDRG）和金属抗性基因（MRG）与细菌共存。弦图表示施用（a）无机肥（IF）土壤和（b）有机肥（OF）土壤网络中的MDRG，MRG和细菌之间的联系。外圈的扇区大小表示各类连线占总连线的相对比例，通过圆心的数量表示各类连线数量。

3 土壤中MDRG和MRG共存的驱动因素

PERMANOVA表明，土壤MDRGs和MRGs共存的77.3%变异可以由施肥（49.1%）和土壤类型（28.2%）来解释。土壤pH、总有机碳、总磷、速效磷和全钾与土壤MDRGs和MRGs的共存呈显著正相关。利用结构方程模型分析气候（年平均气温和年平均降水量），土壤性质（pH和有机碳），选择压力（抗生素和金属），土壤细菌多样性以及粪肥中的MDRG和MRG多样性对土壤MDRGs和MRGs共存的直接和间接影响（图2）。对于施用无机肥的土壤，金属是直接促进MDRGs和MRGs共存的主要驱动因素。共存关系受到土壤pH值的直接影响，以及pH值对金属形态和土壤细菌多样性的间接影响。对于施用有机肥的农田，除了金属的显著影响之外，粪肥中的MDRGs和MRGs对土壤中MDRGs和MRGs的共存具有显著的积极影响。此外，抗生素也直接增强了其共存。与施用无机肥的土壤相比，施用有机肥的土壤增加了土壤细菌群落多样性的影响。土壤总有机碳是影响抗生素和金属的生物可利用性的重要因素。

图2 结构方程模型（SEM）研究多重耐药抗性基因（MDRGs）和金属耐药基因（MRGs）共存的驱动因素。

进一步分析金属和抗生素对特定MDRGs和MRGs共存的影响。选择共现网络中MDRGs（多重耐药外排泵基因mfs、mex、abc、mate和smr）与MRGs之间的正相关连线，以表征其协同增加效应。与施用无机肥的土壤相比（图3a），施用有机肥的土壤中mfs、mex和所有MRG之间的共存增加， abc和As和Ni抗性基因之间存在更多的正相关连线。随机森林模型分析表明，金属和抗生素的选择压力可解释特定的MDRGs和所有MRGs的共存由。铅、镍、铬、镉和喹诺酮类抗生素的浓度是mfs、mex、abc和MRGs共存的主要影响因素（图3b）。

图3 金属和抗生素对特定多重耐药抗性基因（MDRGs）和金属抗性基因（MRGs）共存的影响。

4 MDRG和MRG共存预测土壤抗生素抗性

通过qPCR定量四环素类抗性基因（tetW，tetM，tetO，tetQ和tetH）、磺胺类抗性基因（sul1和sul2）、喹诺酮类抗性基因（gyrA和qnrA）和大环内酯类抗性基因（ermF），进一步评估土壤抗生素抗性。随机森林模型分析表明，MDRGs和MRGs共存可解释土壤抗生素抗性总变化的60％（图4）。mfs、mex、abc、mate与MRGs共存是最重要的预测因子，MSE（%）分别增加18.6、17.4、16.6和16.4，其次是smr和MRGs共存。这些结果表明MDRGs和MRGs的共存可在一定程度上预测土壤中的抗生素抗性。

图4 通过多重耐药抗性基因（MDRGs）和金属抗性基因（MRGs）的共存来预测土壤抗生素抗性。

在这项研究中，作者分析了MDRGs和MRGs共存对农业生态系统土壤抗生素抗性的影响。位于MGEs中的抗性基因的水平基因转移通常被认为是向其他菌株传播抗性的主要机制。获得了ARGs或MRGs的受体微生物可以在抗生素和/或金属的选择性压力下快速适应生境。作者的结果表明，MDRGs和MRGs的共存是粪肥施用后土壤抗生素抗性的最重要预测因子。在粪肥施用的土壤中，MDRGs和MRGs的共存关系增强可能会通过促进抗性基因的水平转移而提高农业生态系统中土壤抗生素抗性。这一结果得到了先前研究的支持，已有研究表明，同时带有ARGs和MRGs的质粒比没有携带两种抗性基因的质粒的结合机会更高。从理论上讲，具有高迁移潜力的MGEs中的遗传偶联抗性可以直接与大部分土壤细菌基因库相关联，从而提高了抗性向特定物种甚至跨门类扩散的概率。

自然情况下，ARGs由抗生素选择，并提供了对抗生素产生者的竞争优势，使宿主细菌能够在高浓度的抗生素下存活。抗性基因通常与为细菌提供抗药性的适应性成本有关。抗性基因的转移为细菌中的基因复制和随后的功能化提供了新的机制，这可能会增加抗性基因的表达水平或有助于其表达的微调。两种方法在抗生素的选择下都是有益的。抗性基因的转移可以为细菌抵抗各种选择压力提供一种适应成本效益机制。因此，当MDRGs和MRGs共存时，它们的高迁移潜力可以提供一种以较低的适应性成本提高土壤抗生素抗性的机制。

基于以上实证研究，作者提出了一个示意图表示来说明施肥影响农业生态系统中土壤抗生素抗性的可能方式（图5）。粪肥中的MDRGs可以直接引入土壤中并与宿主共存。粪肥可以富集土壤中含有固有抗性基因的细菌。固有抗性基因和隐性抗性基因（不一定表达）以及抗性基因前体（编码具有适度抗生素抗性活性或对抗生素具有亲和力的蛋白质）可以通过抗生素和金属选择而激活或适应性突变获得耐药性。这些机制还增强了MDRGs和MRGs的共存或富集含有固有MDRGs的细菌，并通过基因水平基因转移提高了土壤抗生素抗性。

图5 粪肥施用影响土壤抗生素抗性可能机制的示意图。土壤抗生素抗性定义为所有编码与抗生素抗性相关蛋白或可能进化为强效抗生素抗性的类似蛋白的基因，包括固有和获得性抗性基因以及隐性抗性基因（不一定表达）和抗性基因前体（编码具有适度的抗生素抗性活性或对抗生素具有亲和力的蛋白质，这些蛋白质可能会进化成有效的抗性基因）。粪肥施用可以通过以下方式提高土壤对抗生素的抗性：（a）直接引入粪肥中的多重耐药抗性基因（MDRGs），（b）通过粪便进入土壤中的抗生素对MDRGs进行选择，（c）来自金属的共选择压力（d）提高土壤固有的MDRGs，以及（e）通过粪肥施用提高MDRGs和MRGs的共存，这可能通过基因水平转移（结合、转导、转化）提高土壤抗生素抗性。灰色实心箭头表示粪肥施肥后土壤抗生素抗性的变化。蓝色虚线箭头指示MDRG和MRG共存的增强或固有MDRGs的富集。

作者重点研究了由于在农业土壤中施用粪肥而导致MDRGs和MRGs的丰度增加和共存，以及它们对农业生态系统中土壤抗生素抗性增加的危害。结果表明，农业施用粪肥增加了农业生态系统中MDRGs和MRGs的丰度和共存。这可能是由于直接引入了抗性基因，来自抗生素和金属的共选择压力增加，以及刺激了在粪肥施用下获得和转移抗性基因的宿主。这种共存会进一步增加土壤抗生素抗性，对农业生态系统功能和人类健康构成威胁。作者的发现强调了在设计综合策略以控制集约化农业粪肥施用下抗生素耐药性时，必须考虑抗生素和金属的浓度以及MDRGs和MRGs的共存。未来的研究应侧重于确定不同的MGEs及其与MDRGs和MRGs共存的关系。

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