编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。

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所有Qfly均从澳大利亚不同地理位置所采集的易感染水果中收集，具体信息如表1，表3所示。简单而言，我们在一个温度可控的环境实验室中（25 ± 0.20°C，65 ± 3% RH，同时配套11：1：11：1的光：黄昏：暗：黎明的光照周期），将采集的被侵染的水果置于塑料箱内（箱内存在1 cm深的锆石），并分别保存，以防止发生交叉污染的现象。我们从5种果型（共36个幼虫样本）的6个重复果实中采集了3龄（幼虫两次蜕皮之间的虫期）的B. tryoni幼虫。

在测序实验前，首先分别用0.5%（v/v）的Tween 80、0.5%（v/v）的Bleach和80%（v/v）的乙醇溶液对幼虫的表面进行杀菌30s，随后用1*PBS冲洗3次，每次30s。为了检查表面杀菌效果，分别收集第二次和第三次PBS洗涤液100μL用于平板涂布，随后孵育24-48小时。杀菌后，将整个幼虫捣碎，然后将其保存在含有20%甘油的Brain Heart Infusion（BHI）中，于-80°C下保存。所有样品一式两份，一份用于幼虫的鉴定，另一份用于高通量测序。

表1 不同果实中采集的幼虫之间的真菌群落成对比较PERMANOVA检验。

表3 本研究所采集Qfly幼虫的果实类型及果实来源。

1 幼虫的鉴定

我们通过对线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）进行基因分析发现，采自不同水果类型的36条幼虫均为Qfly。此外，从采集的果实发育而来的大约600个成虫在形态学上被鉴定为Qfly。从采集的样品中没有鉴定出其他物种。此外，鉴于在24-48h的培养过程中，在培养基中我们并没有检测到微生物的生长，因此我们有理由认为我们在幼虫的表面所进行的灭菌过程是有效的。

2 Qfly幼虫中真菌分类群的鉴定

我们对36条Qfly幼虫的菌群进行了测序，其中34条幼虫在经过质控和稀释后可用于后续分析。使用97%相似性的聚类阈值下，我们共获得了134个真菌OTUs。这些OTUs并不是完全存在于所有的幼虫菌群样本中。在检测到的134个真菌OTUs中，102个OTUs属于Ascomycota门，占幼虫真菌群落平均总相对丰度的98 ± 1%。而其余的32个OTUs属于Basidiomycota门，平均相对丰度仅为2 ± 1%。在这两个真菌门中，我们所测得的OTUs分属于36个科37个属，然而，几乎一半的reads被分类到Pichiaceae科的一个属，即Pichia（45.4± 6.6%）。事实上，Pichia主要由20个OTUs组成，约占在幼虫中检测到的OTUs的15%。其他优势真菌科包括Saccharomycetales_Incertaesedis（21.4 ± 5.6），Saccharomycetaceae（8.5 ± 4.4%），Trichocomaceae（9.4 ± 4.2）和Saccharomycodaceae（11.1 ± 3.2%）。相对丰度最高的真菌属是酵母菌，这其中包括Pichia（45.4 ± 6.6%）、Candida（21.4 ± 5.6%）、Zygosaccharomyces（7.8± 4.4%）以及Hanseniaspora（11.1 ± 3.2%）（图1）。其他优势真菌还包括Penicillium（8.8 ± 2.9%）和Aspergillus（2.7 ± 2.0%）。其余真菌属的平均相对丰度均小于2%。在检测到的这些属中，只有包括Pichia，Candida以及Hanseniaspora在内的三种真菌属存在于所有幼虫的真菌群中。

图1 Qfly幼虫真菌类群的相对丰度。

3 从不同果源样本中收集的Qfly幼虫之间的真菌群落不同

幼虫样本的真菌群落主要可分为三个不同的簇（图2a-b）。来自人心果样本的幼虫和源自猪里果实样本的幼虫紧密聚集在一起，并且沿第一轴上与青苹果样本和榅桲样本的幼虫明显分开。第一主坐标轴解释了37.1%的β多样性变异。而第二主坐标轴可解释15.3%的总变异度，其中源自石榴样本的群落与其他类群明显分离。成对的统计比较在很大程度上支持这种聚类结果。然而，尽管源自猪里果实样本的幼虫和源自人心果样本的幼虫被聚类在一起，但是这两组的真菌群落具有明显的不同（表1）。

图2 从5种水果类型中得到了Qfly真菌群落的PCoA分析（a）以及幼虫和果实之间的真菌种群的PCoA分析（b）。不同颜色代表从不同水果中分离得到了幼虫。

当在整个幼虫数据集中探究特定真菌属的相对丰度时，果实宿主和幼虫真菌之间存在明显的关系。其中，从猪里果实样本得到的幼虫的真菌群落以Pichia属为主，其平均相对丰度为89.1 ± 4.4%（图1）。通过分析我们发现，在不同重复之间的低标准偏差说明该幼虫在不同重复之间表现出一致性。源自青苹果样本（51.8 ± 13.4%）以及在Whiteside采样点（56.9 ± 13.0%）和Nambour采样点（40.0 ± 15.3%）所采集的人心果样本中，我们所获得的Pichia同样具有较高的相对丰度。尽管在这些水果中所获得的幼虫的平均相对丰度均大于40%，但在其各自分组中都表现出较大的偏差。例如，从青苹果样本中获得的幼虫，Pichia的相对丰度范围从2%到87%不等；而在石榴样本中，Pichia的相对丰度一直很低（<0.05%），仅在其中一个重复中检测到1.1%的相对丰度。

从榅桲样本采集的幼虫中主要以Candida为主，其相对丰度平均为52.4 ± 18.2%（图1）。然而，该真菌属在从猪里果实（3.2 ± 1.7%）和石榴（0.5%±0.5%）样本采集的幼虫中的相对丰度较低，而在Whiteside样地采集的人心果样本（24.0 ± 12.4%）、在Nambour样地采集的人心果样本（17.2 ± 11.1%）和青苹果样本（24.2± 15.2%）收集到的幼虫中相对丰度中等。只有从榅桲和青苹果样本中采集的幼虫的unassigned Basidiomycota的平均相对丰度>1%（榅桲：7.1± 4.8%，青苹果：3.1 ± 2.3%）。

从石榴样本中采集的幼虫中主要以Zygosaccharomyces为主，其平均相对丰度最高，为66.2 ± 22.0%，而在其他样本采集的幼虫中，该菌属的平均丰度均不超过0.05%（图1）。相反，从石榴样本中采集的幼虫中，Hanseniaspora的平均相对丰度很低（0.41 ± 0.4%），而Aspergillus的平均相对丰度较高，为19.8 ± 15.4%，但这主要是由重复间单个幼虫驱动的所导致的。对于采集自人心果样本的幼虫而言，无论是在Nambour采样地（36.2 ± 9.6%）还是Whiteside采样地（12.7 ± 9.3%）采集的人心果样本，在该幼虫中，Hanseniaspora中的相对丰度高于其他样本（图1）。

4 Qfly幼虫中的真菌群落反映了在源自果实中的真菌群落

在36个水果样本中，共有35个样本具有足够的测序深度，用以纳入本研究的后续分析（reads ≥ 10000）。基于测序我们共获得191个真菌OTUs。幼虫和果实样本的真菌群落聚类分析表明，幼虫与其果实宿主的群落紧密聚集在一起（图2a）。成对的统计比较在很大程度上支持了这一发现，其中只有从猪里果实样本采集的幼虫的真菌群落与其宿主本身的真菌群落显著不同（表2）。当将幼虫的真菌群落与其相关的宿主进行比较时，我们可以观察到有大量重叠的真菌群落（图3），同样，在属水平上的平均相对丰度情况也证实了这一点（图1，4）。

表2 宿主果实与其幼虫之间的真菌群落成对比较PERMANOVA检验。

图3 仅存在于幼虫中，或仅存在于水果中或共生于两者的真菌百分比的Venn图。

图4 属水平上，不同类型侵染果实样品的真菌类群的相对丰度。

将从猪里果实样本中分离的幼虫群落与其宿主群落进行比较时，我们在特殊的真菌属的相对丰富度上可以看到一些细微的差别。例如，猪里果实果实中Hanseniaspora（24.3 ± 9.3%）和Candida（38.7 ± 8.6%）的平均相对丰度高于在相应幼虫的真菌群落（5.3 ± 3.7%和3.2 ± 1.7%）。相反，在幼虫真菌群落中Pichia明显富集，平均相对丰度为89.1 ± 4.4%，而在对应的果实中其相对丰度为25.3 ± 3.5%（图1、4）。在果实组织中检测到的属中，只有包括Pichia和Candida在内的两个真菌属存在于所有的水果样本真菌群中（图4）。

基于Illumina高通量测序技术，我们首次对Qfly幼虫的真菌菌群进行综合分析。此外，本研究也首次将Qfly幼虫的真菌生物群与果实宿主的真菌生物群相关联，这为宿主果实真菌生物群对Qfly幼虫真菌生物群形成中可能起到的作用提供了全新的见解。在本研究中，从自然界采集虫害果实后，等到幼虫发育到3龄后再进行对幼虫的采集。所有采集的幼虫经过线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因进行鉴定并进行高通量测序。所有短暂停留的微生物以及常驻微生物菌群（包括致病菌）均被纳入本研究考虑的微生物菌群组成考虑的范围。饥饿效应，一方面可以在清除肠道内容物的同时改变肠道环境，另一方面，对幼虫进行饥饿处理耗时太长，因此本研究所采集的所有幼虫并未经过饥饿处理。本研究中，我们通过比较每种微生物类型在幼虫样本和水果组织中的普遍存在程度，将幼虫中更普遍存在的那些微生物类群定义为常驻微生物。

我们的结果在一定程度上支持了以前基于培养技术的研究结果。Pichia普遍存在于Qfly幼虫的真菌生物群中且更具有多样化，与此同时，先前的研究在果蝇、甲虫和鳞翅目幼虫中同样检测到该菌属。此外，众所周知，Pichia常见于多糖的环境下。这些研究充分的证明了Pichia在幼虫真菌生物群中的存在。然而，本研究发现Qfly幼虫菌群中Pichia的相对丰度与宿主来源有关。例如，Pichia在猪里果实样本采集的幼虫中占优势，约占群落总数的90%，而在石榴样本采集的幼虫中很少见（≤相对丰度为1%）。

除了支持了以前研究基础之外，本研究中使用的非依赖于培养技术的方法大大扩展了我们对Qfly真菌菌群的认知，并率先为宿主和Qfly真菌群之间的关系提供了实验基础。例如，我们在Qfly幼虫菌群中鉴定了包括 Zygosaccharomyces，Penicillium以及Aspergillus在内的以前未知的真菌属。在个别样本中检测到Penicillium和Aspergillus的同时，我们发现Zygosaccharomyces是石榴样本采集的幼虫菌群的标志性真菌组分。酵母菌属在熊蜂的菌群中曾被检测到，但本研究中，它并不存在于所有的幼虫真菌群落中，因此，它不太可能代表昆虫核心真菌生物群的成员。此外，饮食作为影响昆虫肠道微生物群落的重要因素，其对于棉铃虫Helicoverpa armigera，地息甲虫Coleoptera等，以及本研究中从石榴样本中采集的幼虫的微生物群落具有显著影响。

幼虫真菌群落与各自宿主果源的高度相似性表明，这两者之间是紧密相连的。这与之前的研究形成了鲜明的对比，该研究发现幼虫微生物菌群与其宿主果实的微生物菌群具有很大差异。以前的工作表明，宿主幼虫中存在明显的细菌“环境生态位”，并认为他们主要是从成年雌性Qfly那里通过垂直转移所获得的。我们的结果表明，如果Qfly雌虫通过垂直转移将真菌转移到其幼虫身上，那么这些真菌随后将分散在整个果实中。这种真菌在整个果实中扩散的研究已有诸多报道，而这种策略可以增加对幼虫养分的供给。考虑到果蝇主要以水果中的酵母为食，而真菌扩散这一策略将提供酵母供幼虫食用，其增强效果可能是未扩散前的2倍。在本研究中，被侵染的果实多为掉落在树下的过熟果实，由于我们处理的是野生样本，因此无法得知被感染水果的确切侵染时间和真菌开始生长的时间。但由于采收时果实均处于虫害阶段和腐烂状态，因此可以肯定，在这些果实中真菌群落较为丰富。此外，我们收集了所有3龄的幼虫样本，从而为真菌生物群的发育和幼虫与果实之间的相互作用提供了更多的时间。此外，众所周知，酵母通过产生胞外酶从水果基质中释放营养成分，这可能使幼虫更容易获得营养物质。虽然Qfly会消耗个别真菌，但这种互利关系无论是对Qfly还是对真菌而言都是有利的。

另一种有关幼虫与其宿主之间相互联系的关系的另一种解释是，Qfly雌虫不会垂直地将真菌转移到其幼虫身上。相反，我们在研究中所鉴定出的真菌可能独立地定殖到果实上的，在这种情况下，幼虫会通过水平转移从果实中获得真菌。这将意味着幼虫完全依赖于传播，形成特定果实的真菌定植，以促进其自身的生存和发育，而这是一种潜在的危险的生命策略。而就目前来说，Qfly幼虫对真菌生物群或特定类型的真菌的依赖程度还不够清楚，因此无法评估这种风险程度以及哪些真菌会在功能上造成影响。本研究中，不同水果宿主来源的真菌菌群之间的重叠很少，恰恰支持了这种解释。事实上，除了三个属之外（Pichia，Candida以及Hanseniaspora），我们所检测到的OTUs并不完全存在于所有的幼虫样本中，这导致了不同菌属的相对丰度在整个数据集中发生了很大的变化。

有趣的是，在六个果实宿主来源中，除了猪里果实样本及相应的幼虫之外，其它5个样本在宿主和幼虫中具有相似的真菌类群。对于猪里果实样本来说，与宿主果实相比，我们在该样本采集的幼虫中检测到大量的Pichia，这可能是由于幼虫对特定的真菌有明显的饮食偏好所导致。由于不同的真菌在幼虫中的存活率不同，Pichia在幼虫中的存活时间比其他群落成员长。然而，鉴于Pichia存在于本研究的所有果实样本中，这并不能解释为什么在其他水果没有观察到Pichia大量富集的事实。也许与其他水果的幼虫相比，猪里果实中的幼虫需要从Pichia那里获得更多的营养补充，但仍需进一步的研究去验证。

我们探究了果蝇幼虫与其宿主之间共生微生物菌群的程度，以及幼虫与其宿主的真菌生物群在不同宿主果实中的差异程度。我们在果蝇幼虫中发现了多种类型的酵母菌，这其中大部分也存在于宿主果实中。尽管不同宿主类型和伴生幼虫的真菌菌群存在巨大差异，但这两者之间仍存在紧密的关系。我们的发现为了解果蝇生态学提供了有价值的见解，特别是该物种侵染各种水果类型的能力。我们的研究结果对实验室和工厂化饲养过程中的昆虫健康也有一定的帮助。

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