编译：达达兔，编辑：木木夕、江舜尧。

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1、采样点描述和样品采集

试验地在中国陕西，陕西农业科学院东阳长期试验站（37o33′21″N，112o 40′2″E）。该区域年平均气温9.7℃，降水量为321mm。土壤为典型的碳酸盐褐土，砂壤土结构（粘土1.7%，壤土11.6%，沙土86.7%）。2011年起在高粱和玉米轮作中实施施肥实验。主要是想了解施肥对土壤肥力和生产力影响。试验地有6个小区，每个小区15×5m²，设置3个重复。处理如下不施肥（CON）、单施氮肥（N）、单施磷肥（P）、无机肥（NPK）、秸秆还田加上有机肥（MS）、有机肥和无机肥配施（NPKM）、有机肥和无机肥配施加上秸秆还田（NPKMS）以及有机肥和无机肥配施加上秸秆还田和深耕（NPKMSD）。在无机肥（NPK）处理N、P和K的施用量为尿素每年225kg N hm^-2，磷酸氢二铵每年60kg P₂O₅ hm^-2，硫酸钾每年60kg K₂O hm^-2。在MS、NPKM 、NPKMS、NPKMSD处理中，有机肥的应用量为45m³ hm^-2，相当于100kg N hm^-2、60kg P₂O₅ hm^-2、69kg K₂O hm^-2。对于秸秆还田的处理（MS、NPKMS、NPKMSD），每年秸秆还田量为6150kg hm^-2，相当于49kg N hm^-2、11kg P₂O₅ hm^-2、139kg K₂O hm^-2。深耕处理的耕层深度是30cm，其它处理的耕层深度为20cm。

2019年9月，在高粱成熟期采集土壤和植物样品。在相同的高度（60厘米以上土壤表面）收集高粱叶子。将高粱植株从地上移开，高粱根系表面附着的土壤视为根际土壤。所有的样品都装在冰箱里移送实验室中。土壤样品过筛（小于2mm），4℃条件保存，一部分样品立即在−80℃冷冻用于分子分析。高粱叶片样品立即进行DNA提取处理。

2、土壤理化性质测定

采用常规方法测定土壤性质。土壤溶解有机碳（DOC）：用0.45μm的过滤器过滤水土混合液（土壤与水的比例为1：4），分析提取液。以风干土壤为研究对象，在元素分析仪上用燃烧法测定土壤总氮（TN）和总碳（TC）。用流动分析仪测定土壤的铵态氮和硝态氮含量。采用加热-酸消化法提取土壤全磷，用流动分析仪测定。

3、DNA提取

按照制造商说明使用DNeasy PowerSoil DNA分离试剂盒提取土壤DNA。取大约5.0 g的叶片样品加入含有100 ml磷酸盐缓冲液的锥形瓶中，超声振荡5min后置于培养箱中，室温180 rpm振荡1 h，用来收集叶际微生物。利用真空过滤器，将洗涤液通过无菌纱布和0.22μm膜过滤。采用DNeasy PowerSoil DNA分离试剂盒提取叶际样品的DNA。

4、扩增子测序和生物信息分析

用引物515F/806R，ITS1F/ITS2R和F-TAR-euk454FWD1/R-TAReukREV3扩增细菌的16S rRNA、真菌的ITS1区和真核生物的18S rRNA基因。

1、不同植物-土壤之间真核生物群落的组成

本文分析了不同施肥条件下高粱不同区域(包括叶际和根际土壤)和土壤中真核生物群落的多样性和组成的差异。通过对所有土壤和植物样本18S rRNA基因的扩增子测序，一共得到2219616个真核生物序列。在根际土壤和土壤中原生生物是最占优势的真核生物(占总数的33.88%)（图1A）。有孔虫界（Rhizaria）是最丰富的原生生物类群，其次是囊泡虫(Alveolata)、变形虫(Amoebozoa)和叠层虫（Stramenopiles）（图1A）。叶际主要是有孔虫界（Rhizaria）、囊泡虫(Alveolata)和变形虫(Amoebozoa)三种主要类群（图1A）。原生生物在叶际的Shannon多样性明显低于根际土壤和土壤（图1B）。在高粱不同区域之间的原生生物的群落组成存在显著差异（图1C）。源跟踪分析结果表明，根际土壤和土壤中的原生生物类群占叶际的0.90%（图1D）。

图1 高粱不同区域真核生物群落的组成。右图显示原生生物群落的相对丰度（A）。高粱不同区域原生生物群落的Shannon多样性（B）。基于Bray-Curtis的主成分分析(PCoA)，显示原生生物群落的总体分布格局（C）。源跟踪分析显示原生生物在高粱相关部位中的传播（D）。

2、不同施肥处理下原生生物群落的变化

8年施肥处理对高粱-土壤之间原生生物Shannon多样性的影响不显著（图2A）。施肥对高粱-土壤之间原生生物群落组成无显著影响（图2B）。对原生生物纲水平的进一步分析表明，叶际的旋毛纲和钩足类受施肥处理的影响显著（图S2）。

图2 不同施肥处理下高粱区域原生生物群落Shannon多样性的变化（A）。基于Bray-Curtis的原生生物群落主成分分析(PCoA)（B）。不施肥（CON），化肥（NPK），有机肥和秸秆还田（MS），化肥和有机肥（NPKM），化肥和有机肥和秸秆还田及深耕（NPKMSD），化肥和有机肥和秸秆还（NPKMS），“NS”表示没有显著差异。

3、不同施肥处理下原生生物功能群的变化

原生生物的功能类群主要为消费类群、寄生物类群、光养类群和未确定类群（图S3）。在叶际中，消费者型Amoenozoa，明显受施肥作用的影响（图3A）。在根际土壤中，施肥显著提高了寄生生物顶复门（Apicomplexa_X）和卵菌门的相对丰度（图3B）。在土壤中，施肥对寄生生物的顶复门（Apicomplexa_X）和卵菌门以及消费者型的侧口纲（Litostomatea）、变形虫纲（Tubulinea）和Variosea有显著影响（图3C）。

图3 不同施肥处理功能性原生生物谱系相对丰度的响应比。

4、不同高粱-土壤区域原生生物群落的驱动因素

研究人员通过变异分配模型来确定土壤性质、细菌群落和真菌群落在原生生物群落组成变化中的作用。土壤性质、细菌群落和真菌群落对叶际、根际土壤和土壤中原生生物群落变化的贡献率分别为63%、38%和71%（图4）。土壤性质、细菌群落和真菌群落的相互作用是预测所有高粱-土壤区域中原生生物变化的最主要因素（叶际占20%，根际土壤占11%，土壤占18%）。叶际和根际土壤原生生物最重要的预测因子是细菌，而整体土壤原生生物最重要的预测因子则是土壤性质（图4）。

图4通过变异分配模型揭示高粱不同区域土壤性质、细菌群落和真菌群落对原生生物群落的影响。土壤性质包括，pH，DOC,TC,TN,C/N,TP,NO^3--N,和NH4⁺-N。矩阵中的点或由直线连接的点代表相应杆的驱动因素。每个驱动因素的总大小在左边的条形图上表示。底部的图表示每个可能的交集，顶部的图表示交集的出现（即条形图上面的数字）。

共生网络包括原生生物、细菌和真菌类群，表明原生生物在网络中形成了独特的枢纽将网络中的细菌和真菌联系起来（图5）。其中，原生生物门的丝足虫类、绿藻门、水螅类、叶变形虫目、褐藻门和链蜂门等类群与优势菌门和真菌门类群的联系最为密切，而且大部分为正相关。丝足虫门的细菌性动物和杂食性动物与细菌类群存在正相关，而与真菌类群没有正相关作用。细菌类群与真菌类群之间也存在正相关或负相关，这表明在施肥处理条件下土壤中细菌类群具有共同的生态位或竞争关系。

图5共生网络显示了细菌、真菌和原生生物类群之间的联系。红色、绿色和蓝色节点分别代表相关的细菌、真菌和原生生物类群。

本研究进一步建立了结构方程模型(SEM)，探讨施肥、高粱-土壤隔间、土壤性质与原生植物、细菌和真菌群落组成之间的因果关系（图6A）。高粱-土壤区域是形成原生生物和真菌群落组成模式的最主要驱动力，原生生物是细菌群落组成的最重要预测因子（图6B）。原生生物群落对细菌和真菌群落组成也有显著影响。土壤性质和施肥处理重要的预测因子，但是对细菌、真菌和原生生物群落组成的影响不大（图6B）。

图6结构方程模型（SEM）显示施肥处理、作物相关区域、土壤性质与原生生物、细菌和真菌群落组成之间的关系（A）。多种因素对细菌、真菌和原生生物群落组成的总标准化效应（B）。

作物微生物组的空间结构影响了作物质量，包括定植、新陈代谢、植物和微生物互作以及作物性能。作物微生物组的管理仍然是一个较大的挑战，主要是由于各种植物-土壤隔间的微生物群落十分复杂。在农业方面，我们才刚刚开始探索怎么管理复杂的作物微生物群落。然而，原生生物作为微生物群落的重要组成部分，对植物群落的稳定性起着至关重要的作用。

结果表明（图1），在不同的高粱-土壤区域（叶际、根际土壤和土壤）中，原生植物群落存在明显的差异。这表明植物-土壤区域是形成原生生物组成的重要选择力，即使在施肥干扰下也是如此。这一发现与之前有关研究是一致的，即即不同的植物-土壤区域（如叶、根或花）通常拥有特有的微生物群落，尽管原生生物没有被包括在这些研究中。研究结果表明，在高粱相关微生物群落中，原生生物群落以有孔虫界（Rhizaria）为主。

本研究结果表明，原生生物的多样性从根际土壤和土壤到叶部呈下降趋势（图1B），这说明在根-土壤和叶-空气界面寄主选择性生境过滤和原生生物的募集增加。植物具有上皮表面，宿主在上皮表面释放大量的形成作物微生物群落的物质，如营养物质、抗菌素、有机酸和粘液。源跟踪分析表明，根际和土壤仅占叶际原生生物的0.90%（图1D）。植物遗传性状可以调节叶片组织化学和表面的拓扑结构，也可能对叶际原生生物的定植做出贡献。

施肥对原生生物的多样性和组成没有显著影响（图2），这表明原生生物对施肥干扰具有较高的耐受性，但原生生物的消费者和寄生生物的少数功能群对施肥处理的反应比其他功能类群灵敏。在原生生物的营养功能群组中，我们发现施肥对某些原生生物消费者和寄生生物的相对丰度有显著影响（图3），土壤中角尾动物门（Cercozoa）的食细菌线虫、寄生生物和杂食生物对施肥反应显著（图4）。原生生物消费者和寄生生物的变化可能是由于(i)土壤性质或(ii)细菌和真菌群落的变化，它们是原生生物的主要猎物（即食物来源）。总的来说，研究结果强调了作物微生物组中特定的功能群体的消费者和寄生生物对施肥处理的敏感性。

生态学理论认为，与植物相关的微生物群落的组成是由微生物、植物宿主和环境之间复杂的相互作用所控制的。多营养水平微生物之间的生物食物网相互作用（如自上而下和自下而上的过程）对生态系统的功能至关重要，也可以通过拮抗和有益的相互作用改变作物微生物组。本研究的SEM结果显示，原生生物群落可以通过自上而下的调控影响细菌和真菌的群落组成（图6），这些微生物群落的组成呈的正相关关系（图5），这表明细菌和真菌可能是重要的食物来源，通过自下而上的调控影响原生生物的生长。虽然不能直接证明原生生物捕食细菌，但网络分析结果显示细菌捕食者与细菌群落之间存在密切的正相关关系（图5）。

需要注意的是，用于检测潜在食用菌的引物ITS1F/ITS2R并不是最新的，因此它可能会大量扩增植物序列，而且已经被覆盖范围更广的引物所取代。这一问题的解决办法可能是利用新设计的引物对18S rRNA基因的V4基因进行元编码来覆盖角尾动物门（Cercozoa）几乎所有的多样性和内部转录间隔器1（ITS1）来确定卵菌纲（oomycetes）。

研究发现，高粱-土壤不同区域（叶际、根际土壤和土壤）的原生植物群落存在明显差异，这说明即使在施肥处理干扰下，植物-土壤不同区域是形成原生生物群落组成的动力。原生生物的多样性从根际到叶片和土壤到叶片均呈下降趋势。施肥处理对原生生物的多样性和组成没有显著影响，说明原生生物对施肥干扰具有较高的耐受性，但原生生物消费者和寄生生物的少数功能群比其它功能群对施肥处理敏感。

综上所述，本研究提供了一个新的思路，即不同施肥处理显著的改变了高粱相关区域（叶际、根际土壤和土壤）中特定的原生生物消费者和寄生生物的相对丰度。施肥诱导的原生生物群落的变化可能是细菌、真菌群落与土壤性质相互作用的结果，反过来，原生生物可能对细菌和真菌群落施加自上而下的控制，对其调控的生态系统功能和作物性能产生未知的影响。本研究强调了在评估农业管理措施对作物相关微生物群落的影响时必须考虑原生生物及其与其他微生物的相互作用。了解原生生物的动态和食物连相互作用，将为设计具有可预测行为和稳定结果的复杂作物微生物群提供一种方法。日后的植物生物组学研究应考虑植物栖息地内的各个组成部分，特别是在植物健康研究方面。

作物具有大量的微生物群落，为寄主提供巨大利益。原生生物，作为主要的微生物消费者和生物地球化学循环过程中的关键驱动力，但是在植物微生物群落中仍缺乏研究。弄清原生生物在土壤生态过程和农业生产力中的作用至关重要，这将为农业可持续发展和粮食安全提供新的方向。研究人员通过8年的施肥田间试验，研究了不同施肥方式（包括无机、有机和混合施肥）对高粱叶际、根际土壤和土壤中原生生物群落的影响及其与细菌和真菌群落的关系。通过18S rRNA基因、16S rRNA基因和ITS（内转录间隔区）的扩增子测序，研究人员分别对植物-土壤不同区域的原生生物、细菌和真菌进行了鉴定。主要是为了验证以下假设（1）施肥会影响原生生物的功能群；（2）原生生物的变化反过来会改变食物链中自上而下的控制的细菌和真菌群落的组成。结果表明，叶际是原生生物的重要栖息地，主要以有孔虫、囊泡虫和变形虫为主。根际和土壤中原生生物的多样性比叶际显著增加，3种植物-土壤间的原生植物群落结构存在显著差异。施肥明显改变了原生生物消费者和寄生生物的特定功能群。变异划分模型表明土壤性质、细菌和真菌对原生生物群落的变异有明显的预测作用。而原生生物的变化可能反过来也改变了自上而下的食物链中细菌和真菌的群落组成。总之，研究人员提供了新的证据来表明施肥显著影响了与作物相关微生物群中的原生生物消费者和寄生生物的功能群，在集约化农业管理下，这对其生态功能有潜在影响。

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