编译：艾奥里亚，编辑：木木夕、江舜尧。

原创微文，欢迎转发转载。

本研究所选取的Mink Creek流域为放牧和娱乐共存用地，主要有国家森林管理局管理用地以及小部分私人用地组成。本研究于2019年从该流域的14个地点采集了样本，其中爱达荷州环境质量部（Idaho Department of Environmental Quality，IDEQ）在2017年抽样了7个地点（图1）。IDEQ在2017年抽样调查的场地包括样点2、样点4、样点5、样点6、样点7、样点9和样点11。本次研究新增的场地包括样点1、样点3、样点8、样点10、样点12、样点13和样点14。

表1显示了2017年和2019年与1981-2010年相比的温度和降水异常，表明与1981年至2010年的平均降雨量相比，这两个年份的降雨量较少。此外，2017年和2019年相比，2019年偏暖，降雨量相对较大。整个流域都存在娱乐活动（山地自行车、徒步旅行、遛狗、露营、日用），而射击活动大多集中在9号和10号地点。一些地点离露营较近（11号地点和13号地点），而另一些地点则接近日间使用活动（7号地点）。8号站点靠近避暑别墅。放牧发生在样点1、样点2、样点3、样点5、样点9、样点10、样点11、样点12、样点13和样点14附近。

本研究在6个月内（5月至10月）对每个地点进行了7次抽样，共抽取了98份样本。第一次抽样期是在5月底，也就是放牧和休闲季节开始之前。其余的采样周期是基于为了反映整个流域内牛放牧和人类娱乐情况而设定的。图2显示了牛和人移动的空间场地，表2显示了流域内牛的活动情况。表3代表本研究所采用的扩增基因的引物、基因序列及退火温度。表4通过对所采用的数据集的相关矩阵进行分析发现这些数据集中的大多数参数存在相关性关系。表5显示了混合回归方法所采用的模型细节。

图1 样地位置的空间地图以及不同牛群在整个放牧季节的运动情况。

图2 分别代表6月5日（A）、6月20日（B）、7月8日（C）、8月8日（D）、9月5日（E）、10月16日（F）标记的存在牛DNA、人DNA和其他DNA的E. coli超标样点。

表1 气温和降水异常比较。

表2 流域内牛群的运动。

表3 本研究所采用的HF183（人）基因和CowM2（牛）基因引物的核苷酸序列。

表4 田间季节测量的十个变量的相关矩阵。

表5 混合效应回归方法的模型细节。

1 E. coli超标

图3A和图3B显示了E. coli在14个位点和7个测量日期下的变化情况。在采集的98个水样中，E. coli数量超过IDEQ一级接触限值126 MPN/100 mL 34次（占比约35%）。此外，表6还按日期和地点列出了E. coli超标的数量。所有14个地点都至少存在有一次超标现象，而样点1和样点2在7个抽样日期中有4个时间存在超标现象（57%）。在7个样本日期中，只有5月29日没有超标。在7月8日和9月5日两个抽样日期时，在14个抽样点中有10个样点存在超标现象（71%）。相对于二次超标临界值（576 MPN/100 mL），有8个样点存在超标情况。在7月8日时，有5个样点存在超标情况，其超标样点所占比例为所有采样时期最高（36%）。此外，本研究在9月5日的7号样点发现该点的E. coli数最高，为1732 MPN/100 mL。

图4正向Y轴显示了14个样点的E. coli含量，负向Y轴上显示了牛和人的DNA含量。在超过IDEQ标准临界值的34个点中，有20个样点（58.8%）检出人类DNA，2个样点（5.9%）检出牛DNA。此外，有2个样点（5.9%）同时检出人和牛的DNA。另外有10个位点（29.41%）未检测到人和牛的特异性DNA。而非特异性DNA可能主要来源于野生动物或家犬。人类DNA在9月5日时发现最多，包括9个样地。

图3 （A）代表14个样地的E. coli的箱线图，（B）代表按日期标注的E. coli的箱线图。

图4 将14个位点的E. coli与牛DNA和人DNA进行比较。

表6 14个样地中E. coli的超标情况。“#”代表样地中发现牛的DNA，“@”代表样地中发现人类的DNA。

2 E. coli模型结果

采用泊松分布的混合效应回归模型对采样流域的全部14个样点进行了回归分析。表7显示了变量-牛DNA、人类DNA、假期、放牧、pH、DO、电导率、最高气温、降水量和截距的固定影响系数和置信区间。进一步通过分析发现，牛DNA、放牧和DO具有较高的t统计量（tStat>10）。这些变量系数的P值也较小（P值远小于0.01），表明这些变量具有较高的显著性。此外，人体DNA、pH、电导率和截距等变量具有高度显著性（P<0.01）。假日、最高气温和降水量等变量的系数影响较小，表现为低t统计量和高P值。随机协方差估计为正，样地协方差为0.43，样本日期协方差为0.31。样地12和样地3以及日期为7月8日和6月20日的随机效应较高。

图5显示了14个样点的模拟和观察到的E. coli含量。每个样点内的点代表该样点不同采样时间。通过对比可以发现，模型结果与大多数样点的观测数据都表现出较好的吻合，较好地估计了E. coli的低值和峰值。尽管如此，本研究中，我们略微低估了样点5、样点6、样点8、样点9以及样点13下E. coli的峰值。图6还显示了与观测到的E. coli计数相对应的模型。对于大多数观测数据，其结果与模型预测数据相一致。在此基础上，采用K-fold交叉验证方案，利用已有数据集对模型结果进行了验证（R²=0.83，NSE=0.69），这进一步支持了我们模型的可靠性。

表7 模型的固定效应系数与置信区间。

图5 流域内14个样点中我们说观察到的E. coli含量以及预测的E. coli含量。

图6 模型预测与观测数据之间关系。

这项研究的结果表明，E. coli的超标与人类娱乐活动的存在密切相关，其次是来源不明所引起的超标和放牧牛所引起的超标。在34个E. coli超标的样本中，我们在20个超标样本中检测到了人的DNA，2个超标样本中检测到了牛的DNA，2个超标样本同时检测到了牛和人的DNA，另外10个超标样本中检测到了未知来源的DNA。人来源、牛来源、不明来源以及溶解氧的贡献将分别在下面章节中依次阐述。

4.1 人类对E. coli的贡献情况

在34个样本中，有22个样本存在E. coli含量超标（>126 MPN/100 mL）现象，约占比65%。在这22个样本中，有20个样点的DNA仅与人DNA相符（20个样点），另外2个样点的DNA同时与人和牛DNA相符。E. coli超标最多的日期是7月8日和9月5日（各超标10个样本），我们分别在样点4和样点9中发现了人类DNA，而这些采样时期也恰恰处于暑假之后。相关矩阵显示，人类DNA与流域内E. coli有显著的统计学关系。此外，混合效应回归模型发现，假期对E. coli有正向影响（P <0.01）。这一结果进一步验证了先前的研究，即接触人类排泄物比其他来源构成更高的健康风险。

4.2 牛牧对E. coli的贡献情况

在E. coli数量超过126 MPN/100 mL的样本中，有12%的样本（34个样本中有4个）检出牛DNA，其中2个样本仅符合牛DNA，其余2个样本既符合牛DNA又符合人DNA。从牛身上携带E. coli的问题与环境空气温度升高的时期密切相关。与人类相似的是，在这种高温条件下，牛更喜欢靠近水的阴凉地带。当温湿度指数超过72时，人们认为牛处于轻度热负荷状态。对于爱达荷州，该地区温度在华氏79度到80度左右。牛所引起的E. coli超标多是发生在7月8日，该日期的所有样点E. coli含量都超过了二级监管限制（576 MPN/100 mL）。

4.3 不明来源对E. coli的贡献情况

DNA分析在29%的样本中（34例中的10例）既没有发现人的特异性DNA，同时也没有发现牛的特异性DNA。qPCR实验设计的目的是为了寻找牛或人特异性和普遍存在的Bacteroides；因此，我们确信这两个组别不构成污染源。其他可能的E. coli来源没有使用针对其他动物（例如狗）的来源追踪方法直接进行测试。但基于以前的研究我们认为，这种污染可能源于是狗、野生动物或土壤传播大肠杆菌类。

4.4 溶解氧对E. coli含量所起到的作用

当牛在溪流附近放牧或人类在溪流附近进行娱乐活动时，沉积物、营养物质和粪便细菌水平有可能增加。这将增加最终代谢有机物质所需的生物需氧量。在这样一个退化的环境中，微生物的新陈代谢活动将会增加，它们的耗氧量也会增加。因此，当在流域范围内发现大量有机物质时，溶解氧水平将会降低，这解释了本研究中发现的溶解氧与E. coli数量之间的负相关关系。在本研究中，DO与气温呈负相关关系（R = -0.63）。由于该流域内的水流主要由融雪以及春雨所提供，因此我们观测到溶解氧的下降与水流的减少同时发生这一现象。随着夏季水量的减少和水温的升高，这为E. coli的生长提供了最适宜的环境。

4.5 所涉管理问题

由于本研究中，大多数E. coli的环境质量超标都归因于人类，因此有必要提出公共教育和合作土地管理的新方法。美国林业局的员工应该考虑一项娱乐计划，以减缓假期和气温升高时粪便大肠菌群所产生的影响。由于美国西部的非大都市人口增长是全国其他地区的三倍，而且森林和牧场的增长却不成比例，因此提出上述娱乐计划是十分必要的。这需要土地管理者和放牧者共同努力，在不对自然资源造成不利影响的情况下开发放牧和娱乐活动。此外，还可以采取公共普查、教育讲习班、改进的现场标牌、更方便用户的最新网站和教育材料等教育以及管理方法。此外，保持厕所清洁，在河流上游的高使用区设置临时厕所和教育亭等方式，都应该是考虑的备选因素。

本研究的重要发现可列为：

1. 微生物来源追踪标记结合粪便指示菌E. coli被视为是一种量化流域粪便污染源有效的方法。我们可以采用qPCR技术对牛和人相关的E. coli基因进行标记。

2. 流域内超标的E. coli有58.8%对应于人类DNA，其次是来源不明DNA所引起的超标（29.4%）和牛类DNA（5.9%）。同样，在本研究所设定的采样时间内，大部分E. coli超标发生在7月8日和9月5日，每个日期有14个地点（71%）的E. coli含量超标10个。需要注意的是，7月8日有5个样本超过了二级警戒线（576 MPN/100 mL）。

3. 本研究开发了一种利用牛和人的微生物溯源追踪标记来估计E. coli的混合效应回归模型。模型结果与基于k-fold交叉验证方案的观测数据具有较好的一致性（R²=0.83，NSE=0.69）。

4. 在所建立的模型中，人DNA、溶解氧、牛DNA和放牧是E. coli的最显著预测因子（P<0.01）。虽然人类和牛的存在推动了E. coli数量的增加，由于E. coli数量的增加和水流的减少造成的同样造成了水中DO的降低。E. coli对气温和降水量的剧烈变化并未表现出敏感性。

你可能还喜欢

1. 2020年度回顾 | 技术贴合辑
   

2. 2020年度回顾 | 微生态人体微生物类微文大合辑
   

3. 2020年微生态最值得看的环境类微文回顾

   
   

微生态科研学术群期待与您交流更多微生态科研问题

（联系微生态老师即可申请入群）。

了解更多菌群知识，请关注“微生态”。

阅读原文

微信扫一扫
关注该公众号