aBIOTECH | 广东省农科院晏石娟团队开发植物磷酸化和S-亚硝基化修饰组学同步分析技术
蛋白质翻译后修饰（PTMs）如磷酸化和S-亚硝基化在调控蛋白功能和细胞活动中发挥着关键作用，且越来越多的证据表明二者之间存在复杂的相互作用，为植物发育及胁迫响应提供了新的调控维度。然而，由于这两类修饰丰度通常较低且理化性质差异较大，对其进行同步分析仍具有较大技术挑战。现有方法通常依赖于独立或串行的富集步骤，存在实验过程复杂、成本增加、样品损失、两套修饰组学数据关联性不佳等问题。现有技术尚无法实现对磷酸化和S-亚硝基化修饰组学的同步富集与分析。
近日，广东省农业科学院农业生物基因研究中心晏石娟研究员团队在aBIOTECH 发表了题为"A novel proteomics workflow for simultaneous analysis of protein phosphorylation and S-nitrosylation"的研究论文。在该研究中，作者提出了一种基于新型磷酸亲和标签切换技术（PAT-switch）的方法，实现了植物中磷酸化和S-亚硝基化位点的同步鉴定。
PAT-switch方法的分析策略如图1所示，流程包括封闭游离巯基、用PAT标签标记S-亚硝基化半胱氨酸以及还原/烷基化二硫键，随后进行蛋白质消化。利用固定化金属离子亲和层析（IMAC）同时富集磷酸肽和PAT标记肽，经LC–MS/MS分析后，搜索引擎可根据各自的特异性质量增量实现对磷酸化和S-亚硝基化位点的区分和定位。
图1. PAT-switch方法的分析策略示意图
作者首先用S-亚硝基化BSA蛋白验证了PAT-switch检测S-亚硝基化修饰的可行性，并证明其具有较高特异性和灵敏度。随后，以拟南芥幼苗为真实样本，进一步验证了PAT-switch方法的可靠性，并与最新报道的S-亚硝基化分析方法“FAT”和磷酸化检测方法 “GreenPhos”进行对比。同时分析300 μg蛋白样品时，PAT-switch鉴定了2,442个S-亚硝基化肽和4,959个磷酸肽，S-亚硝基化肽的鉴定覆盖率与FAT相当，而磷酸化肽的鉴定数略低于GreenPhos法（图2A）。此外，该方法还适用于小样本量（30 mg植物组织），且平行定量分析的重现性良好，Pearson相关系数分别为0.982（技术重复）和0.967（生物学重复）（图2B-D）。
图2. 拟南芥样品评估PAT-switch方法的性能
为全面鉴定拟南芥的S-亚硝基化和磷酸化位点，作者在LC–MS/MS分析前增加了高pH反相液相分馏，共在拟南芥幼苗中鉴定到12,552个磷酸化位点（6,196个位点置信度打分为Class I）和6,108个S-亚硝基化位点（5,952个Class I）（图3A），其中包含3,795个尚未被主流数据库收录的S-亚硝基化位点。统计分析显示，S-亚硝基化蛋白主要定位于叶绿体、细胞质等代谢活跃区，功能上富集于催化活性和蛋白/RNA结合；而磷酸化蛋白则主要分布在细胞核和质膜，富集于蛋白结合和激酶活性（图3B）。
共有968个蛋白同时发生磷酸化和S-亚硝基化修饰，其中378个为首次鉴定存在双重修饰的蛋白，另外在392个蛋白中发现了新修饰位点。这些蛋白包括雷帕霉素靶标（TOR）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶家族（PPC1、PPC2、PPC3）、BR信号激酶家族（BSK1、BSK3、BSK5-8）、MAPK家族以及部分热休克蛋白。GO和KEGG富集分析均显示，这些双重修饰蛋白大量参与光合作用、碳代谢等核心代谢过程，尤其富集于碳固定、糖酵解和光合作用等生物过程，同时也涉及氨基酸、生物小分子和次生代谢产物生物合成（图3C-D），提示磷酸化和S-亚硝基化修饰可能在植物能源代谢、激素信号通路等复杂网络中存在广泛互作。
图3. 拟南芥磷酸化和S-亚硝基化修饰位点的深度鉴定与功能分析
本项研究获得了广东省科技计划项目、广东省农业科学院现代种业创新能力提升工程等项目的资助。广东省农业科学院农业生物基因研究中心张文洋助理研究员和华南农业大学联合培养硕士生王炎姣为本文的共同第一作者，广东省农业科学院农业生物基因研究中心晏石娟研究员为本文的通讯作者，团队成员李文燕、吴绍文、陈园园、黄文洁及华南农业大学联合培养硕士生叶明洋也参与了该研究，德国马普分子植物生理研究所Alisdair R. Fernie教授为论文撰写提供了指导。
引用本文：
Zhang, W., Wang, Y., Li, W. et al. A novel proteomics workflow for simultaneous analysis of protein phosphorylation and S-nitrosylation. aBIOTECH (2025). https://doi.org/10.1007/s42994-025-00227-2
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