β-1,4-葡聚糖酶促进了植物嫁接过程中砧木与接穗的细胞融合

（1）刘老师，各位师兄师姐，大家下午好。今天我给大家带来的这篇文献呢，是近期发表在Science上的一篇文章，故事虽然不长，但是特别有趣。作者发现了烟草具有强大的嫁接能力，可以与大量被子植物实现科间远缘嫁接，并且找到了一种能够在此过程中促进细胞融合的关键的纤维素酶——β-1,4-葡聚糖酶，这为进一步探索嫁接体中细胞相容的机制奠定了基础。

【通讯作者】

（2）下面，我先对本文的通讯作者，也是本文的一作，进行一下简单的介绍。Michitaka Notaguchi，是日本名古屋大学农业科学院的一名副教授。这个老师非常的低调，搜遍全网也没有找到一张他的照片，仅在他们实验室网站里翻到一张他们的合影，根据面相看的话，感觉是这位。他们实验室，主要就是做嫁接的，致力于阐明嫁接不相容的机制，并利用嫁接体来研究各种植物科学问题，例如植物的免疫机制、物质运输、生物互作等等。近几年实验室十分的高产，今年已经发表了4篇文章了，并且都是关于嫁接的。

【背景】

（3）下面我就对本文的背景，也就是嫁接技术进行一下介绍。

（4）我们都知道，嫁接就是把一种植物的芽或枝接到另一株带有根系的植株上，形成新植株的过程。主要可以分为枝接和芽接，我们把上面的部分称为接穗，下面部分部分称为砧木，如果是三个成分进行嫁接的话，中间的一段称为中间砧。但其实呢，随着嫁接技术的不断发展，可供嫁接的部位已经不再局限于枝或者芽了，几乎植物所有的部分如花序、下胚轴、子房、柱头、胚芽等器官，只要具有较强的生活力，均可以进行嫁接，而且随着组织培养技术的不断成熟，还逐渐发展出了愈伤组织嫁接、离体茎端嫁接、试管苗显微嫁接等。

（5）PPT中展示的是自然界或者园艺生产中常见的一些嫁接的例子，榕树天然就可进行自我嫁接，通过彩色仙人球嫁接在绿色仙人掌上增加观赏价值。以及我们喜欢吃的油桃，它其实也是一种嫁接水果，通过把毛桃嫁接在李子树上，既可以保留桃子的风味和营养价值，又可以具有李子光滑的表皮。此外还可以把茄子与马铃薯、番茄与马铃薯嫁接在一起，既能提高土地利用率，还可以增加经济收益。此外，利用嫁接技术还可以提高作物的抗病性和抗逆性，克服连作危害，提高产量，用于保护濒危物种等等。而且，嫁接作为一种无性繁殖技术，利用其对物种进行改造，也不存在转基因争议，民众更容易接受。

除此之外，在植物科学研究领域内，嫁接也是一种十分重要的研究系统，研究工作者可以利用嫁接技术来研究植物体内物质的远距离运输，信号的转导，不同作物基因组之间的相互作用等等。例如杨郁师姐就通过把野生型和uvr8的根和茎进行相互嫁接，验证了根中的UVR8能够促进侧根的伸长，而不是茎中的。

（6）那么为什么可以利用它来进行物质运输的相关研究呢，嫁接体又是如何形成的呢，这就涉到了嫁接体的发育过程。从接穗与砧木相互接触，到嫁接体的形成可大致分为以下几个阶段：

①坏死层的形成。在嫁接初期，因为切割而受损的细胞的细胞壁以及一些电子致密物质会在在整个嫁接面上堆积，从而形成坏死层。

②而后，随着新细胞的形成和分裂，首先突破坏死层，逐渐扩展使得砧木与接穗得以接触，实现初始的细胞粘连。

③在嫁接2-3天之后，随着细胞的不断分裂，在维管束和皮层处就会形成愈伤组织，为接穗提供机械支持，也使得砧穗之间可以进行水分和营养物质的运输。

④而后就是维管束桥的形成，这是嫁接得以成功的关键环节。在草本植物嫁接三天左右的时间，就可以在愈伤组织中观察到管状分子和筛分子的分化，而后逐渐形成木质部桥和韧皮部桥。

⑤两到三周之后，在二者之间会分化出形成层，最终将接穗和砧木之间原有的形成层连接起来，并继续分化形成更多的维管组织，使得嫁接双方之间的物质交换能够顺利进行，保证嫁接体可以正常生长和发育。

这样一项优秀的繁殖技术，却因为物种亲缘性的存在，仅在同种或同科内有较高的成功率，始终无法突破科的界限，直到1929年，有位科学家成功将茄科植物和仙人掌科植物嫁接在了一起，打破了人们的传统认知，从此科间物种的嫁接，就获得了越来越多科学家们的关注，试图去解释科间嫁接不相容的机制。但直至现在，这一重要的科学谜团仍未被揭开。

【结果】

（7）那作者对这一问题是如何进行探索的呢？

（8）首先他在菊花、大豆和烟草中进行嫁接实验。图A是菊花的同种异株嫁接，图B和C分别是把大豆和烟草嫁接在了菊花上，可以看到，嫁接后的菊花已经开出了孤傲的花朵，而大豆全部枯萎了，神奇的是，烟草却可以正常生长，并且3个月后还收到了种子。于是作者就对他们的横截面进行观察，可以看到，在大豆和菊花之间，有明显的坏死层，而烟草和菊花之间的坏死层却已经被消除了。

之前也有研究人员把龙葵科植物和景天科植物进行嫁接来研究高等植物远缘嫁接不相容的机制，他们就发现在嫁接接触面上两个物种的细胞之间存在坏死层，这个坏死层不会因为愈伤组织的形成而消失，也不会分化出维管组织，甚至还会导致一些淀粉沉积物在此积累，使得砧木与接穗之间无法实现物质、信息的交流，从而导致嫁接失败。因此，坏死层就成为了嫁接过程中细胞不相容的一个标志。

然后作者还进一步用透射显微镜对连接处的茎进行切片观察，可以看到，在大豆和菊花的细胞之间的确存在着折叠的细胞壁，而在烟草和拟南芥之间细胞壁已经变薄，表明烟草与拟南芥的细胞之间已经实现了相互的依附。

（9）其实在此之前科学家们就已经发现了茄科模式植物烟草，具有强大的嫁接能力，那作者将想用烟草在被子植物中进行一个系统性的嫁接试验，经过大量的嫁接实验，最后与38个科的73个物种成功实现了科间的嫁接，因此可以说，烟草就是一个嫁接“万能胶”，能够与一系列被子植物进行嫁接。

（10）背景中也提到过，嫁接后的砧穗之间是依赖物质交流的，那嫁接体中物质的运输情况是怎样的呢？

我们生理课学过，物质在细胞间的运输可以分为共质体运输和质外体运输。其中质外体不进入细胞质，在胞间进行运输，阻力小，速度快快，是一个自由扩散的被动过程，而共质体运输，它存在一个跨膜过程，进入到细胞质中，并且依赖于胞间连丝。

（11）作者首先用质外体运输的示踪剂，甲苯胺蓝浸染拟南芥，第二天发现烟草的茎秆中也可以检测到蓝色，说明嫁接之后他们之间的质外体途径是贯通的，接穗可以从砧木部位吸收水分。

之后又用质外体运输的示踪剂羧基染料CF对砧木的叶片进行浸染后，而后在烟草的韧皮部中也检测到了CF的绿色荧光，也就是说随着细胞之间的相互依附，砧穗之间的共质体运输也开始构建。

然后作者还通过把当把烟草嫁接在转入GFP的拟南芥上，来检测蛋白质在他们之间也是可以运输的。

除此之外，作者在2014年就已经利用mRNA可以在嫁接体内进行运输这一特点，来研究mRNA在长距离运输过程中的机制。

总之，随着接穗和砧木之间维管组织的形成，使得各种物质可以在他们之间进行沟通运输，这是嫁接成功、接穗得以存活的必要条件。

（12）我们不禁想问，烟草“何德何能”可以具有如此广泛嫁接能力，这背后的分子机制是什么？于是作者就对拟南芥和烟草嫁接后2h到28天的连接处的转录本进行RNA-seq分析，发现在嫁接接触面上细胞的快速分裂，形成愈伤组织、木质部桥等的同时，烟草逐渐开始进行受伤响应和修复响应，并且嫁接后1天，一些与生长素、伤口修复、形成层和维管束等发育相关的基因就开始被上调，并且从图C中我们也可以看出，相比于同种嫁接，在异种嫁接中的这些基因的表达量上调的更加明显。

（13）于是作者就想到要把烟草在嫁接早期中表达上调的基因找到，最终锁定了189个基因，对它们进行GO富集分析后发现这些基因主要集中在胞外、细胞壁和木质部中。从图2F中我们可以看到，像编码β-1,4- 葡聚糖酶，β-1,3- 葡聚糖酶，木糖葡聚糖水解酶，扩张蛋白等这样一些参与细胞壁修饰或者重建的酶表达量也激增。并且主要在形成层、髓心部位表达较高。这就说明在嫁接后接穗的活力依赖于嫁接界面维管组织的形成，特别是其中细胞壁的重建和修饰。

（14）而在此之前，就已经有许多文献报道过，无论是在科内物种进行物种嫁接或者植株受伤进行伤口响应的过程中，细胞壁重建的相关基因的表达都会上调。因此，作者就认为，无论是进行科内还是科间嫁接，都存在一个重建细胞壁的过程。

（15）那是否有哪些关键的基因呢？作者就在不能进行科间嫁接的的大豆中寻找这189个基因的同源基因，发现在嫁接之后只有110个基因表达上调了，也就是说很有可能就是这剩余的79个基因的差异表达导致了大豆嫁接失败。于是就对这79个基因再次进行了GO富集分析，发现这些基因这些也主要集中在胞外和细胞壁上，这就再一次证明了烟草之所以可以实现成功的科间杂交，细胞壁的重建这一过程的必要性。

在促进细胞壁重建的基因中，作者关注到了GH9B3这一个基因，它编码了糖苷水解酶家族中的β-1,4- 葡聚糖酶，认为它在植物嫁接过程中发挥着重要的作用。从图C中我们可以看到，烟草在嫁接一天之后GH9B3基因的表达就开始在烟草中上调，3天之后开始显著增加，而在大豆中他的表达却没有显著的变化。

（16）糖苷水解酶9B家族是一类可以催化纤维素分解，从而促进细胞壁的降解的酶，例如当在拟南芥中GH9B3的同源基因CEL1的突变体，根长变短，细胞壁出现褶皱，维管组织的形成也收到了阻碍。

所以作者就猜测，很有可能就是GH9B3基因编码的β-1,4- 葡聚糖酶促进了细胞壁的重建，使得砧穗之间的细胞实现新的粘附。

（17）为了证明自己的猜想，作者首先使用VIGS方法对该基因进行沉默，从D图中可以看到，GH9B3被抑制后，在嫁接界面处会形成坏死层，出现了折叠的细胞壁，细胞缝隙也变大，嫁接成功率显著降低。CRISPR突变体也具有同样的表型。

这就可以说明，NbGH9B3编码的β-1,4- 葡聚糖酶能够促进烟草进行科间嫁接。

（18）那是否GH9B3就是使得烟草具有超能力的关键基因呢？

于是作者就对大豆、牵牛花、玉米中同时进行同种和异种嫁接实验，从图B中可以看出，大豆、牵牛花和拟南芥的同种嫁接过程中GH9B3同源基因均会表达上调，而嫁接在拟南芥上的植物，GH9B3在第一天之后均没有出现上调。

这就意味着，烟草在跨种嫁接过程中能够激活类似种内嫁接的调节机制，使NbGH9B3基因表达上调，促成科间嫁接的成功。

此外，我们从图中可以看到一个十分有趣的现象，那就是玉米它无论是在同种嫁接还是科间异种嫁接，GH9B3都没有表达。作者认为这可能是因为玉米是单子叶植物，它的茎中不具备形成层活性。这也间接证明了GH9B3可以促进细胞壁重建，构建形成层的观点。

（19）那烟草既然具有如此强大的嫁接能力，那我们是不是可以把它作为一个“媒人”，把原本无法嫁接在一起的植物，通过烟草的撮合，把他们连接在一起呢。于是作者就进行了大胆的实验，利用烟草作为中间砧，成功将番茄嫁接在了拟南芥和大豆上。然后还进行了三科嫁接，将大豆嫁接在了花椰菜、长春花等植物上，成功打破了传统上物种亲缘关系对嫁接的限制。

（20）综上所述呢，Michitaka等人发现了烟草可以与被子植物进行广泛的科间嫁接的奥秘，极大的拓宽了嫁接技术的一个应用范围。

然而本实验后续的仍有一些关键的问题有待进一步探究。首先虽然本研究发现了GH9B3在烟草科间嫁接的过程中可以促进细胞之间的相互依附，但其具体发挥功能的机制目前还是未知的。它作为一种纤维素酶，究竟通过将砧木与接穗之间的维管束细胞以及其它细胞的细胞壁上的微纤维进行消解和重塑，从而使得他们之间的细胞可以实现新的粘附。还是因为纤维素降解后触发了细胞整合的监测机制，从而促进了新细胞壁的形成，这目前还是未知的。

此外，还有一个技术上仍待解决的问题就是目前仍无法利用烟草实现单子叶植物的科间嫁接。我们都知道全球三大主要粮食作物，水稻、小麦和玉米都是典型的单子叶植物，如果可以实现单子叶植物的嫁接的话，将会对于世界粮食安全问题具有重要的意义。

最后呢，我想以普渡大学Maureen教授在对本研究的一篇评论文章中的一段话作为结尾，植物生长依赖于两个环境，根伸扎于土地，吸收养分，茎叶直立于空气，享受光照。通过研究人员对嫁接技术的了解不断深入，这一古老的繁殖方法将会帮助植物，也将帮助我们人类，更高效的享受这两个环境所赐予我们的物质和能量。这或许就是嫁接技术之于我们来说最深远的意义。

（21）最后呢，总结一下我这两个月来的工作。主要参与到了志伟师兄的三个课题当中。首先是EDF1课题，构建pGBT9载体进行酵母筛库，寻找互作蛋白。鉴定edf1转基因材料和EMS等位突变体材料，构建高粱和水稻里的APL的转基因载体，在landsburg和fe-1转入ZCN8和EDF1，验证它们的上下游关系和功能，以及通过Dual-luc、Chip-qPCR等试验验证EDF对ZCN8的转录激活以及确定结合位点。

（22）

然后是MOS2的课题，鉴定EMS等位突变体材料和T-DNA插入的双突材料的基因型，以及验证CIS1抑制FLM可变剪接的作用位点。

最后是ZmCRY的课题，构建了CRY1和CRY2的pBridge载体，进行酵母筛库，以及鉴定cry2的纯合无载体的突变材料。

以上就是我这两个月来的一个工作，这一段时间的学习不仅对我的实验技能上有很大的提升，在科研思维和素养上的锻炼也让我有很大的收获。在这里要首先感谢刘老师给我来到我们实验室学习的机会，然后感谢我的两位师兄对我一直以来的耐心指导，以及最后感谢各位师兄师姐这两个月来，包括去年大家在各方面上对我的帮助和认可。很幸运能够拥有这段经历，给我即将正式开始的研究生生活开了一个好头。

（23）最后感谢大家的聆听，如有不足请予以批评指正，谢谢大家。