CRISPR-Cas13系统是一类靶向RNA切割的新型基因编辑技术，已在RNA敲降、碱基编辑、RNA修饰、活细胞RNA示踪以及核酸检测等多个领域展现出广泛的应用潜力。目前已有多个Cas13蛋白家族被相继报道[1-7]，包括Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas13X/Y (Cas13bt), Cas13g-i与Cas13an。利用RNA单碱基编辑技术（由失去切割活性的dCas13蛋白与ADAR2脱氨酶组成），对突变的碱基进行修复是RNA编辑的有力手段，可以潜在应用于医学领域遗传疾病治疗和合成生物学的细胞工厂调控等应用方向。目前，Cas13蛋白融合ADAR2脱氨酶构建的RNA编辑器处于单个AAV的包装极限，无法再融合其他功能蛋白。因此，极小型的Cas13蛋白的挖掘可以为这一瓶颈提供新的解决方案。

该研究通过对土壤微生物大规模宏基因组数据进行智能挖掘，发现一个可高效靶向切割RNA的极小型Cas13j蛋白家族，蛋白大小为424 aa，是迄今已报道的自然界最小的CRISPR-Cas13系统。经过工程化改造，得到了更小的增强型eChiCas13j蛋白，蛋白大小为340 aa。此外，研究人员开发了一套高效的极小型RNA单碱基编辑器工具包，高效实现了小鼠体内的C > U RNA编辑，实现了CRISPR的体内C > U RNA单碱基编辑的治疗应用探索。CRISPR-Cas13j系统的发现与相关RNA编辑工具包的开发，对开发基于RNA编辑的基因治疗手段与合成生物学调控手段等具有重要意义。

本研究通过对土壤微生物大规模宏基因组数据进行智能挖掘，基于Cas13蛋白靶向RNA切割的RxxxxH功能基序，挖掘极小型Cas13蛋白。本研究鉴定出一个新的极小型Cas13j蛋白家族，包括LepCas13j (529 aa) 与ChiCas13j (424 aa)。其中来源于噬几丁质菌 (Chitinophagaceae) 的ChiCas13j是目前已知的最小的天然Cas13蛋白。研究发现LepCas13j与ChiCas13j具有高效的靶向RNA切割活性，展现了与CasRx, Cas13X.1, PspCas13b及Cas13bt1类似的高活性。研究人员以ChiCas13j为骨架，开发出了一系列高活性eChiCas13j工程化改造蛋白，并将ChiCas13j蛋白的大小进一步缩小为340 aa，这也是目前以报道的工程化改造的极小型的Cas13蛋白。

此外，研究人员开发出了一套极小型的RNA碱基编辑工具，Chi-REPAIRv2-mini与Chi-RESCUE-S-mini。这些新型RNA碱基编辑器展现出了极高的A > G与 C > U RNA单碱基编辑效率。本研究将RESCUE介导的C > U RNA单碱基编辑工具通过构建靶向位点PCSK9(Q35*, CAG > UAG)成功应用于体内编辑。对比与RESCUE-S-t1与RESCUE-S-X.1，基于Cas13j的RNA编辑工具Chi-RESCUE-S-mini介导了更高的体内C > U RNA编辑，显著降低了小鼠总胆固醇 (Total Cholesterol, T-CHO)含量，实现了CRISPR的体内C > U RNA单碱基编辑的前沿应用探索。

浙江大学杭州国际科创中心姚远研究员为论文通讯作者，浙江大学马斌研究员、陈学新教授和李果博士（现为湘湖实验室副研究员）为共同通讯作者。浙江大学杭州国际科创中心博士后李果、程亚仙、余静文为共同第一作者。浙江大学黄行许教授、天津大学乔建军教授、上海科技大学季泉江教授、中国农业大学胡晓湘教授等对研究工作给与了技术指导。

该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金重大项目、国家自然科学基金面上项目、中国计算机学会联合基金、浙江大学杭州国际科创中心百人计划等科研项目的支持。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41589-024-01729-8

参考文献

编辑 |余 荷

排版| 王大雪

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