哺乳动物中，生命是由单细胞受精卵发育而来。受精卵卵裂形成桑葚胚，桑葚胚细胞极化进一步发育形成具有不同谱系细胞类型的囊胚。囊胚对应的细胞谱系分别是：囊胚腔内由上胚层（Epiblast）和原始内胚层（Primitive endoderm）组成的内细胞团（Inner cell mass），未来发育成胎儿以及羊膜；囊胚外层致密的扁平细胞，称为滋养层（Trophectoderm），胚胎后期将发育成胎盘等组织；因此上胚层被称为胚内细胞，原始内胚层和滋养层被称为胚外细胞。胚内和胚外组织之间相互作用及其精确调控在维持干细胞自我更新及胚胎发育过程中起着重要作用。但由于囊胚特别是灵长类囊胚难以获得及研究手段有限，对于囊胚时期各谱系干细胞自我更新及其互作机制知之甚少，建立囊胚时期三谱系干细胞系并建立细胞胚胎发育体外模型是研究这一难题的有效手段之一。

虽然囊胚来源的胚胎多能干细胞（Embryo stem cells, ESCs）、胚外内胚层干细胞（Extraembryonic endoderm stem cells ，XENs）和滋养层干细胞（Trophoblast stem cells，TSC）系已经在多种哺乳动物中获得（3-16），并对其生物学特性进行了研究。然而现有胚内、胚外干细胞培养体系相互独立，一来不能模拟早期发育环境；二来无法通过简单的共培养体系来研究早期发育时期细胞互作机制。因此，亟待建立一种能同时维持胚内、胚外干细胞自我更新的培养体系并探究胚胎干细胞与胚胎外干细胞之间的互作机制。

研究团队首先采用激活FGF、TGF-β和WNT信号通路的方法成功从小鼠与食蟹猴囊胚中建立胚胎和胚外干细胞系 （命名为FTW-ESCs，FTW-XEN和FTW-TSCs），并从克隆形态、免疫荧光、嵌合能力和转录组特征等多方面对小鼠与食蟹猴胚内、胚外干细胞系进行全面系统的研究（图1）。

图1，小鼠及食蟹猴FTW-ESCs，FTW-XEN和FTW-TSCs干细胞系。A：小鼠FTW-mESCs/FTW-mTSCs/FTW-mXENs；B：食蟹猴FTW-cyESCs/FTW-cyTSCs/FTW-cyXENs。C：小鼠FTW-XEN、FTW-TSCs的胚外嵌合能力

基于这一培养体系的建立，研究团队得以借助共培养的方法，探索早期胚胎发育中胚胎与胚外细胞如何互作这一基础科学难题。团队分别将小鼠和食蟹猴FTW-ESCs和其不同胚外干细胞（FTW-XENs, FTW-TSCs）进行共培养，实验发现FTW-ESCs与FTW-XENs共培养后，FTW-ESCs增殖速度显著降低，表明XENs对ESCs的具有物种保守性的生长增殖有抑制作用。同时，体内畸胎瘤实验结果也发现和单独注射小鼠FTW-ESCs形成的畸胎瘤相比，同时注射小鼠FTW-ESCs和FTW-XENs形成的畸胎瘤体积和重量明显减小。为了验证体内原始内胚层细胞是否也对对EPI细胞发育具有调控作用，研究人员通过剥除小鼠E6.5-6.75 天内脏内胚层 (visceral endoderm, VE) 24h-48小时后发现，VE 剥离小鼠的EPI增值速度更快细胞且数量更多。同时通过在E2.5小鼠胚胎培养基中添加MEK/ERK抑制剂PD0325901抑制原始内胚层 (primitive endoderm, PrE)形成，发现抑制PrE的胚胎其EPI的细胞数量和对照组胚胎相比显著增加，并且注射成系的FTW-XEN细胞后可以回复EPI细胞数量，进一步证明了PrE细胞对EPI细胞的增殖调控。上述体内、体外实验全面说明了，胚外PrE细胞对EPI细胞的增殖具有重要调控作用（图2）。

图2，体外、体内小鼠FTW-XEN对FTW-ESC的增殖抑制作用。A-D：畸胎瘤实验；E-F：分离小鼠E6.5-7.5胚胎，+/-VE对Epi增殖的影响；H-J：囊胚期胚胎+/-VE体外培养证明VE对Epi的增殖抑制作用

为了揭示XENs (PrE) 与ESCs (EPI)之间的互作机制，研究人员过对小鼠和食蟹猴共培养细胞和单独培养细胞进行了单细胞测序。深入分析揭示XENs通过细胞外基质（如层粘连蛋白和胶原蛋白等）调控ESCs的增殖。通过在小鼠和食蟹猴FTW-ESCs培养基中加入不同细胞外基质（MATRIGEL，LAMININ，COLLAGEN IV等）有效抑制了FTW-ESCs的增殖。更加有力的实验结果表明：敲除小鼠FTW-XENs Laminin-γ1 (Lamc1)或者敲除小鼠FTW-ESCs integrin β1 (Itgb1)可以减轻共培养的 FTW-ESCs 的延迟生长。以上实验结果揭示并证明了胚外内胚层细胞通过细胞外基质信号抑制胚胎干细胞的增殖（图3）。

图3 XEN细胞通过细胞外基质调控ESC增殖。A：Cellchart分析细胞互作；B：敲除ECM关键蛋白LAMC1，及其互作因子Ibtg1对细胞互作的影响；C：胚胎早期发育细胞互作模式图

灵长类原始内胚层细胞的自我更新机制研究相对处于空白。为了更好回答这个科学问题，研究团队首先从人的多能性干细胞分化获得稳定FTW-hXENs细胞系 (hXENs)。通过一种培养条件获得三个物种（小鼠，食蟹猴，人）的XENs使得团队可以更好的对小鼠、食蟹猴和人胚外内胚层细胞做跨物种比较分析。通过物种间分析，团队找到了XENs保守调控的关键基因。除一些已知与原始内胚层发育相关的基因（例如GATA4, GATA6, SOX17, PDGFA）外，还包含一些之前未报道过与原始内胚层发育相关基因（例如SRC, JAK2, PIK3R1, CCL2），通过这些基因的敲除实验，进一步阐明这些新发现的功能基因XEN的不同物种多能性维持中起重要作用（图4）。

图4，小鼠 (FTW-mXENs)、食蟹猴 (FTW-cyXEN) 和人FTW-XENs (FTW-hXENs) 跨物种分析(A)，关键基因的验证（B）

综上所述，该研究成功在同一培养条件下获得小鼠与灵长类食蟹猴胚胎干细胞和胚外干细胞系，为剖析哺乳动物早期发育过程中不同谱系间细胞互作的分子机制开辟了新的途径。研究中开发的干细胞共培养条件不仅有助于建立更接近体内胚胎的干细胞胚胎模型，也为干细胞培养体系优化和分化提供了新的途径。

美国得克萨斯州西南医学中心终身教授吴军、省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室/昆明理工大学灵长类转化医学研究院谭韬/季维智，中国农业大学生物学院魏育蕾为该论文共同通讯作者；中国农业大学生物学院魏育蕾，昆明理工大学省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室/灵长类转化医学研究院张娥、慈百全，中国科学院动物研究所于乐谦为本论文的共同第一作者。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.008

魏育蕾，中国农业大学生物学院教授，博士生导师。2022年“杰出人才”引进学者，国家海外高层次人才获得者。现实验室招聘基因编辑、细胞生物学、发育生物学、分子生物学、胚胎学等方向博士后科研人员，有意者联系：https://cbs.cau.edu.cn/art/2022/11/1/art_31829_887741.html；邮箱：yulei.wei@cau.edu.cn

于乐谦，中国科学院动物所，研究员，博士生导师。2021 “MIT-35岁以下科技创新35人”中国区获得者，国家海外高层次人才获得者。现实验室招聘助理研究员，副研究员等在编科研人员，有意者点击主页：http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/202210/t20221031_6542329.html；联系邮箱：leqianyu@ioz.ac.cn 

参考文献