编者按：蛋白质是直接参与生命活动的关键生物大分子，其异常往往和疾病相关。蛋白质异常除我们熟知的蛋白丰度的异常、蛋白质翻译后修饰的异常之外，亚细胞定位的异常也是不可忽视的一种情况。分析亚细胞组织蛋白质及其动态变化，即被称之为Spatial Proteome，对深入了解细胞生物学所不可或缺，但是传统的高通量研究方法如转录组测序无法用于相关研究。

随着生物质谱、高分辨显微镜技术的发展，使得研究人员可以了解蛋白质亚细胞水平的动态变化和调控。日前，Nature Reviews上发表了名为：Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology的综述，文章系统总结了spatial proteomics这一细胞生物学研究的前沿及其进展。文章中作者表示Spatial Proteomics这一技术，最终帮助我们更深入地了解疾病的机理，细胞信号通路和细胞器的动态变化。我们将前两类基于生物质谱的spatial proteomics的相关内容小结，以飨读者。

Spatial Proteomics常见有三类方法（图 1），前两类都是基于蛋白质质谱的方法，分别研究亚细胞组分中蛋白以及蛋白-蛋白相互作用网络；第三类是基于显微成像分析蛋白亚细胞定位。今天我们主要介绍前两者。

 图1 Spatial proteomics常见三类方法

A，利用生物质谱分析亚细胞组分蛋白组成；B，利用生物质谱分析蛋白相互作用网络；C，基于抗体的高分辨显微镜

蛋白质质谱可以对复杂生物样本中的蛋白进行定性和定量分析。其流程是，首先对细胞器或亚细胞结构如外泌体exosome进行分离，通过蛋白质质谱分析蛋白种类及其含量变化。虽然亚细胞组分的分离不能达到非常纯的地步，但是现在的定量蛋白质组学可以通过亚细胞组分的富集，进行无偏差分析，将背景污染排除在外，以获得更准确的结果。

早在1964年，诺贝尔奖得主De Duve就提出，定位于某一细胞器的蛋白通常用相似的profiles，因此可以利用该特性将其与纯化过程中的污染蛋白区分。但是长期以来缺乏高通量蛋白质组学分析方法而没有成功的案例。直到2003年，Matthias Mann实验室利用兴起的蛋白质组学将上述理念付诸实际，他们在Nature上发表文章Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling，研究鉴定了23个新的centrosome蛋白。此后，研究人员分别利用蛋白质质谱分析了lipid droplets，线粒体，溶酶体和transport vesicles等亚细胞结构中的蛋白质组成。

此外，蛋白质质谱还可以用于分析病原微生物和寄主细胞相互作用过程，阐释病原微生物感染的机理。2014年，哈佛大学Steven Gygi教授课题组，利用蛋白质组学分析巨细胞病毒CMV感染纤维母细胞的过程中，细胞质膜蛋白的动态变化，不仅分析了CMV病毒入侵途径，同时还揭示病毒蛋白如何躲避寄主免疫攻击。相关研究以为题Quantitative temporal viromics: an approach to investigate host- pathogen interaction发表在著名期刊Cell上（图 2）。

 图2 利用生物质谱分析CMV病毒感染fibroblasts细胞期间膜蛋白的动态变化，揭示病毒蛋白逃脱寄主细胞免疫的机制

蛋白质质谱还可以与亲和层析（AP）结合，用于分析蛋白互作网络。2015年，德国马普所的研究人员分析人类1125个GFP标签蛋白的转基因细胞系，分析与标签蛋白的互作况，鉴定到5400种蛋白，以及28500多种蛋白相互作用。相关研究以A human interactome in three quantitative dimensions organized by stoichiometries and abundances为题，发表在著名期刊Cell上。2017年，哈佛大学的研究人员更进一步，研究人类5800多个蛋白的相互作用，鉴定到56000多种蛋白相互作用，其中87%的互作方式是新发现的。相关研究以Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks为题，发表在著名期刊Nature上。

上述两篇论文分析整个细胞中所有蛋白的互作网络，因此构建了数千个转基因细胞系，工作量非常大。相对而言，细胞器中蛋白质种类要少1-2个数量级，因此分析细胞器中蛋白互作网络，工作量上小很多，对解决某一生物学问题的帮助可能更巨大。

一个好的例子是分析藻类叶绿体中pyrenoid互作网络的工作。大气中的CO2会被光合自养生物所吸收并转化为有机物，这其中有超过30%的CO2是真核藻类固定的。藻类叶绿体中有一个特有的蛋白结构pyrenoid用于CO₂浓缩，以提高CO₂同化效率。但是我们对该细胞器的蛋白组成了解甚少。研究人员只用了38个baits，利用蛋白质组学鉴定了89个定位于pyrenoid的蛋白。相关研究以A spatial interactome reveals the protein organization of the algal CO2 concentrating mechanism为题（图3），发表在著名期刊Cell。

 图3 利用蛋白质组学分析CCM 定位蛋白的互作网络

如何降低蛋白互作中的假阳性是该领域中的一个重点，而临近标记Proximity labelling就是一个好的解决方法，常见的临近标记方法有engineered ascorbate peroxidase（APEX）和proximity-dependent biotin identification （BioID）。在两类方法中，bait蛋白首先融合一个酶，可以biotinylated所有在空间上与之足够近的蛋白（小于10-20nm），之后通过streptavidin进行亲和富集，结合蛋白质质谱就可以鉴定和bait直接或间接作用的蛋白。

2017年cell上发表了两篇利用proximity labelling和蛋白质组学分析膜蛋白在ligan激活前后互作蛋白动态变化的文章。“An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells”的文章利用APEX技术，该技术由著名华裔科学家，斯坦福大学教授Alice Ting实验室发明。研究人员将APEX和G蛋白偶联受体融合，在配体刺激后的不同时间点，利用APEX捕捉与目标GPCR在空间上临近的蛋白，并通过定量蛋白质组学分析GPCR信号传导过程中蛋白网络相互作用的信息（图4）。

 图4 利用APEX捕捉与目标GPCR在空间上临近蛋白，并通过定量蛋白质组学分析GPCR信号传导过程中蛋白网络相互作用的信息

近年来，随着基因组学、转录组学、代谢组学技术的发展，我们可以在不同的分子水平，在组学水平了解生物过程，极大地增加了我们的认识。然而，细胞内的区室化使得我们无法利用上述方法了解区室内蛋白的组成和变化。

随着高通量蛋白质质谱技术和高分辨显微成像技术的发展，spatial proteomics的研究逐渐成为可能，这些技术不再是少数实验室所专业，更多的研究人员逐渐意识到蛋白质质谱和蛋白质组学在其工作中的重要性。

无论是在阐述细胞区室化对细胞功能的调控，药物对靶蛋白定位变化的影响，药物对细胞内蛋白质相互作用的变化，这些之前比较难分析的项目，现在我们有了研究的工具，期待越来越多的研究人员加入到spatial proteomics的研究中，也期待更多的中国学者也能用上该利器。

参考文献：

Emma Lundberg  and Georg  Borner , (2019), Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology. Nature reviews in Molecular cell Biology.