Toll 样受体 （TLR） 在启动先天免疫反应中起着重要作用。虽然大多数 TLR 位于质膜上，但 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9 可识别内体中的致病核酸。这些内体 TLR 需要伴侣蛋白UNC93B1才能稳定和从内质网 （ER）-高尔基体到内溶酶体的运输.一旦进入内体，这些 TLR 的胞外结构域必须被内肽酶切割，然后 TLR 才能有效地感知核酸。内体TLR的不当运输导致小鼠严重的自身免疫.除病原体衍生的核酸外，TLR7、TLR8 和 TLR9 还可以识别内源性核酸，并与自身免疫性疾病有关，例如银屑病、系统性硬化症和系统性红斑狼疮 （SLE）。

在SLE中，TLR7的RNA感应和TLR9的DNA感应是疾病发病机制的关键，但潜在的分子机制差异很大。活化的浆细胞样树突状细胞 （pDC） 表达高水平的 TLR7 和 TLR9，并分泌大量 I 型和 III 型干扰素 （IFN）。这种快速细胞因子反应是由 pDC 中 IRF7 和 NF-κB 的组成型表达介导的，而 NF-κB 分子途径是其他免疫细胞（如巨噬细胞）中的主要反应介质。pDC 代表了树突状细胞的独特谱系，需要转录因子 E2-2 来发育和维持其身份。pDC 可以通过内体 TLR7 和 TLR9 被自身核酸激活并产生大量 IFN-I31.反过来，pDC衍生的IFN-I可以激活髓系细胞，直接调节T细胞和B细胞的分化。人类和小鼠模型中系统性红斑狼疮的发病机制以过度的IFN-I信号传导为特征。pDC 中 IFN 产生的失调有助于多种自身免疫性疾病（如 I 型糖尿病、银屑病、系统性硬化症和 SLE）的致病扩增14,36–39.在小鼠中，pDC缺乏可有效预防系统性硬化症和SLE的发病机制。因此，pDCs异常产生IFN-I是自身免疫的重要驱动因素。

S-棕榈酰化是一种可逆的翻译后修饰，其中半胱氨酸残基共价连接到饱和 C16 脂质棕榈酸酯上。棕榈酰化状态有助于蛋白质结构和稳定性、囊泡运输和膜锚定。DHHC蛋白酰基转移酶的一大家族可以S-棕榈酸化高尔基体、胞质溶胶或细胞膜中的蛋白质。几种类型的水解酶，如酰基蛋白硫酯酶和棕榈酰蛋白硫酯酶，可以分别使胞质溶胶或溶酶体中的蛋白质去棕榈酰化。在免疫系统中，棕榈酰化循环已被证明对几个关键的细胞通路和免疫过程（如 STAT3、MYD88 或 NOD1/2 信号通路）和免疫过程（如 PD-L1 降解和抗原交叉呈递）很重要。然而，棕榈酰化的重要性尚未在系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中得到证实。

在这项研究中，发现 S-棕榈酰化调节 pDC 和巨噬细胞中的 TLR9 反应。TLR9 在胞外结构域中携带至少两个 S-棕榈酰化位点。棕榈酰化循环始于高尔基体，DHHC3 棕榈酰化 TLR9，结束于溶酶体，其中 PPT1 脱棕榈酰化 TLR9。TLR9棕榈酰化循环直接调节配体结合和pDC和巨噬细胞的细胞因子分泌。因此，在转基因SLE小鼠模型中，PPT1遗传缺陷或PPT1抑制剂可降低自身抗体水平并减轻肾炎。棕榈酰化抑制剂还抑制系统性红斑狼疮患者人 pDC 产生的 IFNα。研究概述了一种调节TLR9反应的翻译后修饰机制，并提出了治疗自身免疫性疾病的潜在免疫治疗靶点。

TLR9 和 TLR7 是 S-棕榈酰化

PPT1 是一种参与去棕榈酰化蛋白质的酶。为了研究棕榈酰化在SLE中可能的作用，我们分析了几项棕榈酰化蛋白质组学谱研究。TLR9被发现存在于一个蛋白质组数据库中。因此，我们开始探索TLR9可能被棕榈酰化的可能性。使用点击化学可以准确检测棕榈酰化的所有位点，包括 S-棕榈酰化和 O-棕榈酰化位点。使用叠氮基棕榈酸（也称为Click-iT棕榈酸，叠氮化物）标记，我们发现在RAW264.7小鼠巨噬细胞系中表达的小鼠TLR9（mTLR9）被棕榈酰化酰基-生物素交换 （ABE） 是另一种特异性检测 S-棕榈酰化的传统方法。我们进行了ABE并确认mTLR9是S-棕榈酰化。Calnexin 是一种表征良好的 S-棕榈酰化蛋白，用作阳性对照，RAB7 用作阴性对照。两种生化试验均表明小鼠TLR9被棕榈酰化。

基于与ABE相似的原理，我们对mTLR9进行了质谱分析。我们发现两个半胱氨酸残基 C258 和 C265 被 S-棕榈酰化。这两种氨基酸位于胞外结构域中富含亮氨酸的重复序列 8 （LRR8） 和 LRR9 之间的小环中。然而，这两个棕榈酰化位点不在Z环中，即实际的配体结合槽。然后，我们继续用丙氨酸（C258A + C265A，Mut2）取代这两种半胱氨酸，并在TLR9缺陷的RAW264.7巨噬细胞系中稳定表达该突变体。S4C-E).在ABE测定中，我们发现C258A和C265A突变使mTLR9的棕榈酰化水平降低了3倍。由于TLR7在SLE发病机制中也起着重要作用，我们研究了TLR7的棕榈酰化状态。使用点击化学和 ABE 测定，我们发现 mTLR7 是 S-棕榈酰化。总之，我们发现小鼠 TLR9 和 TLR7 是 S-棕榈酰化。

接下来，检查了人TLR9（hTLR9）的棕榈酰化状态。ABE 测定表明，在人单核细胞系 THP-1 或 293 T 细胞中表达的 hTLR9 也被 S-棕榈酰化。在这里，我们发现TLR9在人类细胞中被S-棕榈酰化。

结论

结果表明，TLR9棕榈酰化循环有两个主要步骤：高尔基体中的棕榈酰化和内体中的去棕榈酰化。通过进行细胞分离实验，我们发现DHHC3缺陷细胞在高尔基体中保留了更多的全长TLR9，而在内体中发现了较少的裂解TLR9。因此，棕榈酰化是将TLR9从高尔基体转运到内体所必需的。内体中较少裂解的 TLR9 将导致 TNF 分泌减少，这在 DHHC3 缺陷细胞中观察到。关于去棕榈酰化步骤，使用Co-IP实验探测UNC93B1上保留的TLR9的量，我们发现在HDSF处理的细胞中与UNC93B1结合的TLR9较少，这也导致TLR9信号传导减少。总之，TLR9 棕榈酰化调节 TLR9 从高尔基体到内体的运输，TLR9 去棕榈酰化控制内体中UNC93B1释放 TLR9。抑制任一步骤都会导致内体中游离裂解的TLR9减少，从而减少信号传导。与此一致，HDSF治疗和PPT1缺乏均显著减缓了SLE的发病机制。然而，2-BP处理对体内自身抗体的产生影响不大。对 DHHC3 缺陷小鼠的进一步研究应进一步阐明 TLR7/9 棕榈酰化的重要性。

TLR7 已被证明是 SLE 发病机制的重要信号通路。使用点击化学和 ABE 测定，我们发现 TLR7 也是 S-棕榈酰化。然而，DHHC3 过表达不能使 TLR7 棕榈酰化，这表明其他 DHHC 可能是 TLR7 棕榈酰化的原因。更重要的是，ABE分析显示，TLR7在R848激活后未被去棕榈酰化。相比之下，TLR9 在 CpG 激活后迅速脱棕榈酰化，即使在 24 小时后仍保持脱棕榈酰化。此外，PPT1 的过表达不会导致 TLR7 去棕榈酸化。PPT1抑制剂HDSF也不能改变TLR7棕榈酰化水平。总之，TLR7 不参与与 TLR9 相同的棕榈酰化/去棕榈酰化循环。裂解的 TLR7 不需要从UNC93B1中释放，而 TLR9 需要。PPT1 对 TLR9 的去棕榈酰化促进了其在溶酶体中配体结合之前从UNC93B1释放，而 TLR7 可能不需要去棕榈酰化来启动下游信号传导。因此，在 PPT1 缺陷小鼠中观察到的表型不太可能主要是由于 TLR7 的紊乱去棕榈酰化。

数据揭示了一种调节小鼠和人类 TLR9 和 TLR7 反应的高尔基体溶酶体棕榈酰化途径。我们发现，这种内体棕榈酰化/去棕榈酰化循环的破坏抑制了 pDC 和巨噬细胞中 TLR9 配体结合和细胞因子的产生。PPT1 遗传缺陷或化学抑制抑制了 B6 中的抗 DNA 自身抗体并减轻了肾炎。Sle1yaa小鼠。鉴于其在 cDC1 和 pDC 中的相反作用，PPT1 可能是 SLE 治疗的潜在药物抑制靶点，因为 PPT1 可能具有增强 CTL 对癌症和病原体反应的额外益处。

本文目的蛋白TLR分子棕榈酰修饰质谱检测试剂盒由Aimsmass Co.Ltd提供，如上图所示，对mTLR9进行了质谱分析。我们发现两个半胱氨酸残基 C258 和 C265 被 S-棕榈酰化。这两种氨基酸位于胞外结构域中富含亮氨酸的重复序列 8 （LRR8） 和 LRR9 之间的小环中。

针对于棕榈酰修饰，近几年时间发表的高分文献，均是关于特定目标蛋白修饰的研究，以及上下游相关作用蛋白分子的交互所引起的生物学效应，棕榈酰修饰本身是相对于常规磷酸化，泛素化以及乙酰化等修饰发生较少的一种脂酰修饰，本文科学家通过调研前期其他科研工作者的组学数据通过进行快速的WB检测（可考虑Aimsmass试剂盒，AM10313&AM10314），随后通过质谱MS检测其棕榈酰修饰位点，得到可靠棕榈酰修饰数据。

Mass spectrometry

Sample preparation with ABE was previously described68,69. RAW264.7 cells carrying mTLR9-Flag were lysed, solubilized and immunoprecipitated with anti-FLAG affinity beads (Sigma, A2220). After washing with 1 ml of lysis buffer three times at 4 °C, the beads were subjected to the ABE assay preparation procedure and an alkylation reaction using an IP-ABE Palmitoylation Kit for MS (Aims, AM10417) following the protocols on the manufacturer’s instruction sheet. The eluted sample was used for further MS analysis.

转载出处【Nature Communication IF=17】周期性棕榈酰化调节小鼠的 TLR9 信号传导和自身免疫

原文出处：https://www.nature.com/articles/s41467-023-43650-z

棕榈酰修饰https://www.aimsmass.com/s-palmitoylation.html

特定蛋白棕榈酰修饰免疫印迹试剂盒 https://www.aimsmass.com/products/AM10313.html

特定蛋白棕榈酰修饰免疫印迹试剂盒（含HRP）https://www.aimsmass.com/products/AM10314.html

特定蛋白棕榈酰修饰质谱试剂盒 https://www.aimsmass.com/products/AM10417.html