常见癌症的共享新抗原是癌症免疫治疗发展的重要领域，为开发通用型癌症治疗方法提供了重要依据。常见癌症共享新抗原许多是癌细胞驱动基因突变产生的。这些突变基因常常包括P53，EGFR，KRAS，BRAF，EGFR，HER2，IGH1和PIK3CA等。
确定共享新抗原与人类HLA白细胞相关抗原（HLA）是否相配是癌症T细胞免疫治疗中的关键环节，这有助于精准选择治疗靶点，开发更有效的免疫治疗方案。目前主要通过实验检测和计算预测两种方式来判断它们之间的匹配情况。
实验检测：
主要包括高通量时间分辨荧光能量转移（TR-FRET）分析：构建含有特定新抗原和 HLA 等位基因的条件性 HLA 复合体，用来测试新抗原多肽和HLA分子是否能稳定结合，通过荧光信号的变化，给新抗原和HLA的“匹配度”打分，帮我们快速找到能配对的组合。
免疫沉淀质谱（HLA-IP-MS）分析：使用工程化的“HLA 单等位基因”细胞系，共表达多个候选新抗原序列，再引入特定 HLA 等位基因。通过质谱分析，检测与 HLA 结合的新表位抗原多肽。这种方法能直接验证新表位与 HLA 在细胞环境中的结合情况 。研究中利用该方法，在表达特定 HLA 等位基因的工程细胞中，验证了 TP53 R175H 等新表位与 HLA 的结合。
计算预测：
运用 NetMHCpan 等算法，考虑 NetMHC 结合亲和力（BA）% Rank 等参数来预测新表位与 HLA 的结合情况。当 % Rank≤2 时，认为新表位可能与 HLA 结合 。但计算预测存在一定局限性，不能完全准确判断突变蛋白在细胞环境中是否能被加工和呈递新表位。
NetMHCpan 系列是目前应用最广泛的工具预测之一，基于人工神经网络（ANN），整合了 MHC 分子的序列特征、肽段序列及已知的结合数据，预测肽段与特定 HLA-I 类等位基因的结合亲和力。输出肽段的结合亲和力（IC₅₀值，单位 nM）和百分排名（% Rank）。通常认为 %Rank ≤ 2 时，肽段与 HLA 的结合能力较强，可能为有效结合的新抗原。可预测 8-14个氨基酸长度的肽段与 HLA-A、B、C 等位基因的结合，支持多种常见及稀有 HLA 等位基因（如 HLA-A02:01、HLA-B58:01 等）。
NetMHCIIpan专门用于预测肽段与HLA-II类分子的结合，原理与 NetMHCpan 类似，适用于较长肽段（15-24 个氨基酸）。
MHCflurry基于深度学习模型，结合迁移学习优化预测性能，尤其在训练数据较少的 HLA 等位基因上表现更优，输出结合亲和力和预测概率。基于结构的分子动力学模拟。通过构建 HLA 分子与新抗原肽段的三维结构模型，模拟两者相互作用的动态过程，计算结合自由能等参数，评估结合稳定性。能直观展示肽段与 HLA 分子结合的关键氨基酸位点（如锚定残基），解释结合机制，适用于验证特定肽段与 HLA 的匹配性。
整合加工与呈递过程的预测工具（Immune Epitope Database (IEDB) 综合分析工具。整合了抗原加工（如蛋白酶体切割、TAP 转运）和 HLA 结合预测，模拟新抗原从产生到呈递的完整过程，提高预测准确性。通过综合评分，优先选择同时满足加工效率高和 HLA 结合能力强的肽段。
NetCTLpan专门针对细胞毒性 T 细胞（CD8⁺ T 细胞）识别的新抗原，结合肽段的 HLA-I 结合亲和力、蛋白酶体切割效率和 TAP 转运效率，预测潜在的免疫原性肽段。预测结果的验证与筛选标准包括，结合亲和力：IC₅₀ <50 nM 为强结合（SB），50-500 nM 为弱结合（WB），>500 nM 为非结合。差异亲和性指数（DAI）：需满足 DAI > 10（突变肽段与野生型肽段的亲和力比值），确保新抗原与 HLA 的结合能力显著优于野生型，避免免疫耐受。
局限性：计算预测需结合实验验证（如 HLA-IP-MS、T 细胞活性检测），因算法可能受训练数据偏差影响，存在假阳性。
关于体外 T 细胞激活的功能实验
主要包括分离并扩增目标 T 细胞，使用负载候选多肽的 HLA 四聚体进行磁珠分选或流式分选（针对已知 TCR 识别的肽段），需富集抗原特异性 T 细胞；. T 细胞激活的功能性检测，将负载多肽的 APCs 与 T 细胞共培养，通过 ³H - 胸腺嘧啶掺入法或 CFSE 染色检测T细胞增殖（激活的 T 细胞会发生克隆扩增）；细胞因子释放检测：采用 ELISA、ELISPOT 或 CBA（流式细胞术微球阵列）检测 T 细胞分泌的细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-2 等），IFN-γ 的释放是T细胞激活的经典标志；细胞毒性实验，针对 CD8⁺ T 细胞，使用⁵¹Cr 释放实验或流式细胞术检测其对负载多肽的靶细胞（如肿瘤细胞、表达对应 HLA 的靶细胞）的杀伤活性；表面标志物检测，通过流式细胞术检测 T 细胞表面激活标志物（如 CD69、CD25、CD44 高表达），激活的T细胞会快速上调这些分子；特异性验证，使用无关肽段（与 HLA 无结合或非特异性肽段）、未负载肽段的 APCs 作为阴性对照，排除非特异性激活。若候选肽段能诱导显著高于对照组的增殖、细胞因子释放或细胞毒性，则表明其可特异性激活该个体的 T 细胞。
进阶验证：TCR 克隆与特异性分析，TCR 测序与克隆对激活的 T 细胞进行 TCRβ 链测序，鉴定其互补决定区（CDR3）序列，明确特异性 TCR 克隆。通过基因工程技术（如慢病毒转导）将该 TCR 克隆到初始 T 细胞中，验证其是否能介导对候选肽段的特异性反应，排除其他因素干扰。
在临床T细胞免疫治疗应用上需要快速实用简便的检测方法，而在临床 T 细胞免疫治疗应用中，确实也存在一些相对快速、实用且简便的检测方法，能够帮助医生评估治疗效果、监测病情变化。这些方法在不同层面上反映 T 细胞免疫功能，为临床决策提供重要依据。主要方法包括，利用流式细胞仪可快速检测不同 T 细胞亚群的数量和比例，反映机体细胞免疫状态。操作流程相对标准化，样本处理时间通常在数小时内，能为免疫治疗疗效评估提供即时数据，如判断免疫重建进程、监测感染风险。在肿瘤免疫治疗中，可监测治疗前后 T 细胞亚群变化，评估治疗对免疫系统的影响 ；酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：该方法针对分泌特定细胞因子（如 IFN-γ、IL-2 等）的 T 细胞，将待检细胞与包被特异性抗原的固相载体共孵育，T 细胞分泌的细胞因子会与载体上的抗原结合，通过酶联显色反应形成斑点。其灵敏度高，可检测单细胞水平的细胞因子分泌，样本用量少，能直观反映机体对特定抗原的 T 细胞免疫应答强度。检测耗时一般 1-2 天，常用于感染性疾病（如结核感染）、肿瘤免疫治疗中评估 T 细胞的免疫活性；T 细胞斑点试验（T cell spot test）：基于 T 细胞对特异性抗原的识别能力，在固相载体上展示特定抗原，刺激 T 细胞活化形成细胞斑点，计数斑点数量反映 T 细胞数量和活性。检测周期一般在 1 天左右 ；乳酸脱氢酶释放试验（LDH）：原理是杀伤性 T 细胞裂解靶细胞后，LDH 会释放到细胞培养液中，通过检测上清液中 LDH 活性来反映 T 细胞的杀伤能力。操作简单、成本较低，可在较短时间内（数小时）获得结果，适用于评估 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤效果；简化的 T 细胞增殖试验（CFSE 染色）用荧光染料 CFSE 标记 T 细胞，若多肽能激活 T 细胞，T 细胞会增殖并稀释 CFSE 荧光，通过流式细胞术检测荧光强度降低的细胞比例，反映增殖活性。优势：无需放射性试剂，孵育 3-5 天即可检测，操作简便，能直观反映 T 细胞的克隆扩增能力（活化的 T 细胞会大量增殖以发挥抗肿瘤作用）。上述方法各有侧重，可根据需求选择。这些方法均无需复杂的基因编辑或高通量测序，适合作为多肽免疫原性的简便验证工具。
T 细胞的激活通常需要抗原呈递细胞（APC）的参与，但在特定条件下，没有 APC 也可能发生激活，具体取决于激活方式和 T 细胞类型。在人工干预或特定实验条件下，部分 T 细胞可绕过 APC 激活，但这种激活具有局限性。当抗原肽浓度极高时，可能直接与 T 细胞表面的 TCR 结合，通过 TCR 聚集激活下游信号（如 ZAP70、LAT 磷酸化）。但这种激活效率低，且缺乏共刺激信号，往往仅能诱导部分活化标志物（如 CD69）表达，难以引发完整的增殖和细胞因子分泌（如 IFN-γ），也无法形成有效的抗肿瘤免疫反应。工程化T细胞或记忆T细胞，记忆 T 细胞：已被抗原致敏的记忆 T 细胞对激活信号的要求较低，在高浓度抗原肽刺激下，可能无需 APC 即可短暂激活（如分泌细胞因子），但仍需共刺激信号才能充分增殖。CAR-T 细胞：通过基因工程改造的 CAR-T 细胞，其嵌合抗原受体（CAR）可直接识别肿瘤表面抗原（无需 MHC 呈递），在体外可被抗原直接激活，但体内仍需免疫微环境中的细胞因子支持才能持续发挥作用。
HLA 基因型决定 T 细胞对多肽的应答能力个体的 HLA 基因型（如 HLA-A02:01、HLA-B58:01 等）决定了其能有效呈递的多肽类型。例如，若某患者的 HLA 型为 HLA-A02:01，只有能与 HLA-A02:01 结合的多肽（如某些肿瘤突变肽）才能被呈递，进而激活对应的 T 细胞；若多肽无法与患者的 HLA 分子结合，则无法诱导特异性 T 细胞激活，相关免疫治疗也会失效。
能通过一些相对简单、依赖现有工具和实验的方法筛选出与特定 HLA 分子相匹配的多肽，这些方法无需复杂的高通量设备，适合基础实验室或临床初步筛选，具体如下：
基于生物信息学的预测（快速初筛），这是最简便、成本最低的初筛方法，利用成熟算法预测多肽与 HLA 的结合潜力，明确目标 HLA 等位基因：先通过基因分型确定需要匹配的 HLA 类型（如 HLA-A02:01、HLA-B58:01 等）。
选择预测工具，NetMHCpan（推荐）：输入多肽序列（8-14 个氨基酸，HLA-I 类）或更长序列（HLA-II 类）及目标 HLA 等位基因，输出结合亲和力（IC₅₀，nM） 和百分排名（% Rank）。判定标准：通常选择 %Rank ≤ 2（表示该多肽与 HLA 的结合能力优于 98% 的随机肽段）或 IC₅₀ < 50 nM 的多肽，视为高潜力匹配肽。优势：无需实验操作，在线工具（如https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.1）可直接使用，数分钟内获得结果，适合快速缩小候选多肽范围。
体外结合实验（验证预测结果）
对预测的高潜力多肽，通过简单实验验证其与 HLA 分子的实际结合能力，常用方法：
HLA 分子-肽结合实验（ELISA 法）将重组的可溶性 HLA 分子（如 HLA-A*02:01）包被在酶标板上，加入荧光标记或生物素标记的候选多肽，孵育后检测结合信号（如荧光强度或显色反应），信号越强说明结合越稳定。优势：操作简单，商业化 HLA 分子和检测试剂盒（如 Thermo Fisher 的 MHC 结合试剂盒）可直接购买，实验周期 1-2 天，适合验证少量候选肽。
肽竞争结合实验，用已知能与目标 HLA 强结合的 “参照肽”（带标记）与候选肽竞争结合 HLA 分子，若候选肽能抑制参照肽的结合（即标记信号降低），说明其与 HLA 存在结合能力，抑制率越高结合越强。优势：无需标记候选肽，适合筛选未标记的合成多肽，成本低、易操作。
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