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多重qPCR中的无中生有:荧光通道间的交叉干扰

已有 157 次阅读 2025-7-23 15:42 |个人分类:大小鼠病原体检测|系统分类:科研笔记

  以往的qPCR检测多为单重检测,随着检测技术的发展,多重qPCR因能显著提升效率(省时省力)而于临床检测中越发受到关注。然而,多重qPCR实验也会面临一些技术挑战,其中之一便是“漏光”现象——即荧光通道间的交叉干扰。了解并克服它是获取可靠结果的关键。

 

一、问题的发现:并非扩增的“扩增曲线”

在一次实验中(相对荧光值法-log),我们进行了三重体系的扩增检测。奇特的是,虽然只在体系中加入了FAM通道的模板,HEX通道却也出现了明显的扩增曲线。这显然不符合预期。检查原始曲线后确认,HEX通道实际上并无真实的扩增信号。

 

扩增曲线图(相对荧光值法-log):

 图片.png

 

原始曲线图:

 图片.png

 

二、问题的来源:算法与物理特性的双重影响

经过分析与多方咨询,问题主要来自于两方面:

1.算法影响:扩增曲线算法选择了“相对荧光值法-log”,此算法的优点在于能更清晰地显示出微弱的扩增信号(尤其适用于多重实验中信号强度变化差异大的情况,此时若是选择与原始曲线差异不大的绝Abs olute Quantification荧光值法便可能会误导结果判读)。

 

扩增曲线-Abs olute Quantification荧光值法:

图片.png 

可以看到绝Abs olute Quantification荧光值法下的扩增曲线HEX很平坦,但仍与阈值线有交叉。

2.物理特性:荧光染料的发射光谱并非特点典型的单峰,而是具有一定宽度的“波包”。这导致相邻通道(如FAM & HEX/VIC, CY5 & ROX)间存在一定程度的光谱重叠,从而产生信号干扰(通常低于1%,但也存在仪器间差异,建议定期校准仪器)。

下面用这次实验中的FAMHEX通道的原始曲线荧光强度做个展示。

 

FAM通道原始曲线13循环处荧光:

 图片.png

 

FAM通道原始曲线35循环处荧光:

 图片.png

 

HEX通道原始曲线13循环处荧光:

 图片.png

 

HEX通道原始曲线35循环处荧光:

 图片.png

 

本次实验中HEX受到FAM“漏光”的程度:(46.69-20.62/4635.65-2580.53=0.0127

 

三、问题的优化策略

荧光光谱重叠是物理本质,虽难以消除,但可通过策略尽可能减少干扰影响:

1.结合实验设计忽略无模板通道:

在已知特定通道无目标模板的多重检测(如同系列实验或固定试剂盒方案)中,明确忽略该通道结果即可。

2.原始曲线辅助判读是关键:

无论算法如何处理,原始曲线代表了仪器探测到的原始荧光信号。当扩增曲线形态异常(如本例或基线设置不当导致时),回归原始曲线是判断真伪扩增的关键。

3.仪器定期校准:

按照仪器制造商的要求进行定期校准,好的设备是保障实验正常开展的基础。

4.巧妙避免算法影响:

相对荧光值算法利用了除法放大信号变化,这样一来若是本底信号本身够强(比如预载相应探针),便能有效覆盖交叉干扰带来的本底变化,使得在相对荧光值法下,该通道也能保持明显的非扩增状态。

下面是来自上海翼和SPF级大小鼠国标病原体检测系列试剂盒的“国标必检病毒联检”项目的阳性对照PC3,该阳性对照无ROX通道模板,但由于联检试剂盒ROX通道有对应探针,本底信号覆盖了干扰。

 

翼和国标必检病毒联检PC3扩增曲线(相对荧光值法-log):

 图片.png

 

翼和国标必检病毒联检PC3原始曲线:

 图片.png

 

 

 



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