定量蛋白质组学是蛋白质组学的一个重要分支，其核心目标是在特定生物系统

（如细胞、组织、体液）中，不仅鉴定出存在的蛋白质，

更重要的是精确测量这些蛋白质的相对或绝对丰度（表达量）

及其在不同条件（如疾病 vs 健康、处理 vs 对照、不同时间点）下的变化。 它超越了简单的“蛋白质列表”，揭示了蛋白质表达的动态信息，

对于理解生命过程、疾病机制、发现生物标志物和药物靶点至关重要。 核心目标 相对定量： 比较两个或多个样本中同一蛋白质的丰度差异

（例如，健康细胞 vs 癌细胞，处理前 vs 处理后）。结果通常表示为差异倍数（Fold Change）。 绝对定量： 确定样本中特定蛋白质的绝对摩尔浓度或拷贝数。

这对于临床诊断、药物代谢动力学等应用尤为重要。 蛋白质丰度谱： 绘制特定状态下样本中所有可检测蛋白质的相对或绝对丰度图谱。 关键技术方法 定量蛋白质组学高度依赖高分辨率、高灵敏度的质谱技术，并结合各种标记或非标记策略： 1. 基于质谱的标记策略 text 复制 下载 *   **体内标记：**    *   **SILAC：** 将稳定同位素标记的必需氨基酸

（如¹³C₆-精氨酸、¹³C₆-赖氨酸）掺入活细胞蛋白质中。

标记“重”样本与未标记“轻”样本混合后进行质谱分析。

质谱能区分轻重肽段，通过峰面积比进行相对定量。适用于细胞培养模型。 *   **体外标记：**    *   **iTRAQ/TMT：** 使用具有相同质量报告基团但不同同位素组成的化学标签，

在蛋白质或肽段水平标记不同样本的肽段（最多可达16-18重）。

所有样本混合后进行LC-MS/MS分析。在MS2谱图中，

报告离子峰的强度比反映不同样本中该肽段的相对丰度。

通量高，适用于多种样本类型（细胞、组织、体液）。    *   **ICAT：** 用含稳定同位素的化学标签特异性标记半胱氨酸残基。

简化了肽段混合物，但覆盖度受半胱氨酸含量限制（现在较少用）。    *   **Di-methyl labelling:** 一种简单、经济的肽段N端或赖氨酸侧链体外标记方法。 *   **靶向绝对定量标记：**    *   **AQUA/PSAQ/SIS:** 合成已知浓度的、

带有重同位素标记（如¹³C, ¹⁵N）的“重”合成肽段（目标肽段的标准品），

将其以已知量添加到样品中。样品中的天然“轻”肽段与添加的“重”标准肽段在质谱中共洗脱，

但具有不同的质荷比。通过比较“轻”肽段和“重”肽段的峰面积（或峰高），

利用已知浓度的“重”肽段，可以计算出样品中目标蛋白质的绝对量。

通常需要抗体富集目标蛋白/肽段（如SISCAPA）。 2. 基于质谱的非标记策略 text 复制 下载 *   **Label-Free Quantification：**    *   **基于谱图计数：** 统计特定蛋白质被鉴定到的MS/MS谱图数量。

谱图计数越多，通常表明蛋白质丰度越高。方法简单，但线性度和准确性相对较低。    *   **基于峰强度/面积：** 在LC-MS/MS运行中，对每个肽段离子（或其前体离子）

在色谱图上的峰强度或峰面积进行积分。对同一蛋白质的所有肽段的信号进行整合

（如Top3, iBAQ, APEX），计算该蛋白质的相对丰度。需要严格的数据采集重现性和归一化处理。

不需要预先标记，成本低，理论上无通量限制（样本需单独上机分析）。 3. 基于数据非依赖采集的数据提取定量 text 复制 下载 *   **SWATH/DIA：** 与传统的DDA（数据依赖采集）不同，

DIA将质谱扫描范围划分为连续的、固定宽度的窗口，

并依次对每个窗口内的所有离子进行碎裂和采集。

获得的是所有肽段离子的混合MS2谱图。

然后利用预先建立的样品特异性或公共的谱图库，

从混合的DIA数据中提取特定肽段的色谱峰并进行定量。

这种方法具有高重现性、高覆盖度和保留原始数据的优点，便于后期重新挖掘。 4. 基于抗体的方法 text 复制 下载 *   **蛋白质印迹：** 传统方法，通量低，半定量，主要用于验证。 *   **免疫组织化学/免疫荧光：** 提供空间定位信息，但通量低，定量精度有限。 *   **反相蛋白质微阵列：** 将大量蛋白质样品点在芯片上，

用特异性抗体检测目标蛋白。通量较高，但依赖抗体的质量和特异性。 *   **邻近延伸分析/邻位连接技术：** 利用一对抗体结合目标蛋白，

引发DNA报告分子的延伸或连接，通过qPCR或测序实现高灵敏、高特异性的多重定量（如Olink平台）。 工作流程概览 样本制备： 根据样本类型（细胞、组织、血浆等）进行裂解、

蛋白质提取、还原烷基化、酶解（通常是胰蛋白酶）。 定量标记（如适用）： 使用SILAC, iTRAQ/TMT, LFQ等策略。 色谱分离： 通常使用高效液相色谱将复杂的肽段混合物按时间分离（LC）。 质谱分析： 使用高分辨率质谱仪（如Orbitrap, Q-TOF）

进行肽段离子化（ESI）、一级质谱扫描和肽段碎裂（MS/MS）。 数据库搜索： 将获得的MS/MS谱图与理论蛋白质数据库进行比对，鉴定肽段和蛋白质。 定量计算： 根据所用方法（同位素标记峰强度比、

LFQ峰面积/强度、谱图计数等）计算蛋白质的相对或绝对丰度。 生物信息学分析： 数据归一化、缺失值处理、统计学分析

（寻找显著差异表达的蛋白质）、功能富集分析（GO, KEGG等）、蛋白质相互作用网络分析等。 验证： 通常使用WB、PRM/SRM（靶向质谱）或基于抗体的方法对关键发现进行验证。 应用领域 疾病生物标志物发现： 在癌症、神经退行性疾病、

心血管疾病等的体液（血液、尿液、脑脊液）

或组织中寻找差异表达的蛋白质作为诊断、预后或疗效监测的标志物。 药物靶点发现与验证： 研究药物处理对细胞或组织蛋白质组的影响，

发现潜在的新靶点或验证已知靶点的作用机制。 药物作用机制研究： 阐明药物如何影响信号通路、蛋白质相互作用和翻译后修饰。 信号通路研究： 动态监测细胞在刺激（如生长因子、胁迫）

下信号通路中关键蛋白质的丰度变化和修饰状态。 蛋白质相互作用研究： 结合亲和纯化-质谱，定量比较互作蛋白在不同条件下的丰度变化。 翻译后修饰研究： 特异性富集磷酸化、糖基化、乙酰化等修饰肽段，进行定量分析。 系统生物学： 整合转录组、蛋白质组、代谢组数据，构建更全面的生物系统模型。 挑战与发展方向 动态范围： 生物样本中蛋白质丰度跨越多个数量级

（血浆中可达10¹⁰），低丰度蛋白（如细胞因子、膜受体）检测困难。 覆盖度： 当前技术仍无法覆盖整个蛋白质组，尤其是低丰度蛋白和组织特异性蛋白。 通量与成本： 深度覆盖的高通量分析成本高昂。 数据复杂性与分析： 海量数据的处理、标准化、归一化、统计分析和生物学解释是巨大挑战。 绝对定量的准确性与标准化： 实现高精度、高通量的绝对定量仍需发展更可靠的方法和标准品。 翻译后修饰分析的深度和广度： PTM的复杂性给富集、鉴定和定量带来额外难度。 单细胞蛋白质组学： 克服单细胞蛋白质含量极低的挑战，

实现单细胞分辨率的定量分析是当前最前沿的热点之一。 空间蛋白质组学： 在组织原位保留空间位置信息的同时进行

蛋白质组定量分析（如MALDI成像质谱升级、基于抗体的空间组学）。 整合多组学数据： 将定量蛋白质组数据与基因组、转录组、

代谢组等数据进行整合分析，获得更系统的生物学认识。

总结

定量蛋白质组学是生命科学和医学研究中的强大工具，

它使我们能够动态、全局性地观察蛋白质的表达水平，

揭示生物过程的调控机制和疾病发生发展的分子基础。

随着质谱技术、标记方法、分离技术和生物信息学的不断进步，

定量蛋白质组学正朝着更高灵敏度、更高通量、更高覆盖度、

更高定量精度以及单细胞和空间分辨率的方向快速发展，其应用前景将更加广阔。