原文链接：Interspecific interactions facilitate keystone species in a multispecies biofilm that promotes plant growth | The ISME Journal | Oxford Academic (oup.com)

Microorganisms colonizing plant roots co-exist in complex, spatially structured multispecies biofilm communities. However, little is known about microbial interactions and the underlying spatial organization within biofilm communities established on plant roots. Here, a well-established four-species biofilm model (Stenotrophomonas rhizophila, Paenibacillus amylolyticus, Microbacterium oxydans, and Xanthomonas retroflexus, termed as SPMX) was applied to Arabidopsis roots to study the impact of multispecies biofilm on plant growth and the community spatial dynamics on the roots. SPMX co-culture notably promoted root development and plant biomass. Co-cultured SPMX increased root colonization and formed multispecies biofilms, structurally different from those formed by monocultures. By combining 16S rRNA gene amplicon sequencing and fluorescence in situ hybridization with confocal laser scanning microscopy, we found that the composition and spatial organization of the four-species biofilm significantly changed over time. Monoculture P. amylolyticus colonized plant roots poorly, but its population and root colonization were highly enhanced when residing in the four-species biofilm. Exclusion of P. amylolyticus from the community reduced overall biofilm production and root colonization of the three species, resulting in the loss of the plant growth-promoting effects. Combined with spatial analysis, this led to identification of P. amylolyticus as a keystone species. Our findings highlight that weak root colonizers may benefit from mutualistic interactions in complex communities and hereby become important keystone species impacting community spatial organization and function. This work expands the knowledge on spatial organization uncovering interspecific interactions in multispecies biofilm communities on plant roots, beneficial for harnessing microbial mutualism promoting plant growth.

摘要

定殖于植物根部的微生物共存于复杂的多物种空间结构生物膜群落中。然而，人们对建立在植物根部的生物膜群落内的微生物相互作用和基本空间组织知之甚少。在此，我们将一个成熟的四物种生物膜模型（嗜根寡养单胞菌、解淀粉类芽孢杆菌、氧化微杆菌和后弯黄单胞菌，简称 SPMX）应用于拟南芥根部，研究多物种生物膜对植物生长和根部群落空间动态的影响。SPMX共培养显著促进了根系发育和植物生物量。共培养的 SPMX 增加了根部定殖，并形成了多物种生物膜，在结构上不同于单培养形成的生物膜。通过将 16S rRNA 基因扩增片段测序和荧光原位杂交与共聚焦激光扫描显微镜相结合，我们发现四种生物膜的组成和空间组织随着时间的推移发生了显著变化。单培养的解淀粉类芽孢杆菌在植物根部的定殖能力很差，但当其驻留在四种生物膜中时，其种群数量和根部定殖能力都会大大增强。将解淀粉类芽孢杆菌排除在群落之外会降低生物膜的总体产量和三种菌的根定殖率，从而失去促进植物生长的作用。结合空间分析，我们发现解淀粉类芽孢杆菌是一个关键物种。我们的研究结果突出表明，弱根定殖者可能会从复杂群落中的互利相互作用中获益，从而成为影响群落空间组织和功能的重要基石物种。这项工作拓展了空间组织方面的知识，揭示了植物根部多物种生物膜群落中的种间相互作用，有利于利用微生物的互利性促进植物生长。

图 1 随着时间的推移，SPMX 对拟南芥根系生长和茎鲜重的影响； (A) 接种 SPMX（由 S. rhizophila、P. amylolyticus、M. oxydans 和 X. retroflexus 组成的四物种菌群）共培养物七天的拟南芥幼苗的生长表型（比例尺 = 1 厘米）； (B）箱线图图显示接种 SPMX 共培养物5、10、15天时拟南芥幼苗的主根长度（厘米）（n = 9）； (C)箱线图显示接种 SPMX共培养物5、10、15天时拟南芥幼苗的茎鲜重（毫克）（n = 9）； 每组数据基于三个独立实验的九个生物重复（n = 9）；根据 Wilcoxon 秩和检验（Wilcoxon test），统计意义表示 SPMX 处理的植株与对照植株之间的差异。

图 2  SPMX 共培养物和单培养物在拟南芥根部的定殖； (A) 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）捕获的代表性图像，显示接种SPMX 或四种菌株之一的M. oxydans (Mo)、S. rhizophila (Sr)、X. retroflexus (Xr) 和 P. amylolyticus (Pa) 五天（D5）时细菌在拟南芥根部的定殖情况； 用 SYTO9 染色法观察细菌定殖情况； 根部用钙氟白 (CFW) 染色（比例尺 = 50 μm）； (B) 条形图显示了通过共聚焦图像三维定量分析量化的混合 SPMX 和四种单个物种在根部定殖的生物量。条形图上方的字母表示统计差异； (C) 条形图显示 SPMX 共培养和单培养定殖整个根部的细菌细胞总数，以菌落形成单位（CFU）测定法量化，并以平均根长（毫米）归一化；条形图上方的字母表示统计差异。

图 3 SPMX 在根表面形成的多菌种生物膜的 FISH 共聚焦激光扫描显微镜（FISH-CLSM）显微照片； (A) FISH-CLSM 图像显示了本研究中使用的每个物种以及混合物种群落中所有四种菌株（SPMX）的细胞形状和大小；左侧四幅图像显示的是单个物种，最右侧一幅图像显示的是 SPMX 混合群落。Pa（P. amylolyticus）、Mo（M. oxydans）、Xr（X. retroflexus）和 Sr（S. rhizophila）分别用 Cy5、Cy3、太平洋蓝和 FAM 标记（比例尺 = 5 μm）； (B) 来自 SPMX-根部共培养样本和未接种细菌的根部样本（对照）的代表性 FISH-CLSM 图像，从样本的根部一侧可视化了多菌种生物膜随着时间（D5、D10 和 D15）的形成； 根部形成的多菌种生物膜用白色虚线框和箭头表示，根部区域在图像中标出；左侧的插图表示采集显微照片的根部位置；根部显微照片包含四通道独立图像和合并图像（比例尺 = 10 μm）； (C) 柱状图显示在整个根部上 5、10 和 15 天（D5、D10 和 D15）形成的多物种生物膜中的估计细胞总数，由 qPCR 确定，并按平均根长（毫米）归一化；数据基于每个独立实验中三个根样本的三个生物重复（n = 9）；Kruskal-Wallis 检验用于检测根部细胞总数随时间变化的统计差异： "ns "表示 "不显著（P >.05）"，***表示 P < .001 （经 FDR 调整），**表示 P < .01 （经 FDR 调整）。

图 4 根上形成的四物种生物膜中各物种的相对丰度随时间变化；(A) 主坐标分析（PCoA）显示了由 M. oxydans (Mo)、S. rhizophila (Sr)、X. retroflexus (Xr) 和 P. amylolyticus (Pa) 组成的四物种群落 (SPMX) 在组成上的总体差异，根据四物种在三个不同时间点的丰度（每个时间点 n = 3；PERMANOVA，相关系数 R2 = 0.85，P = .003），使用 Bray-Curtis 距离计算得出；群落组成由 16S rRNA 基因测序数据估算得出； 

(B) 柱状图显示了根据 16S rRNA 基因测序数据，拟南芥根部定殖的四个物种相对丰度的差异组成，以及每个物种在 D5、D10 和 D15（n = 3）时随时间的丰度变化；使用 Kruskal-Wallis 检验法检验三个不同时间点之间相对丰度的统计差异： "ns "表示 "不显著（P >.05）"，**表示 P < .01（经 FDR 调整），*表示 P < .05（经 FDR 调整）。

图 5 植物根部四种和三种生物膜群落的空间组织和功能差异； (A) 通过 FISH-CLSM 捕捉到的 Z 叠三维视图显示接种后 5 天、10 天和 15 天（D5、D10 和 D15）根表面由 M. oxydans (Mo)、S. rhizophila (Sr)、X. retroflexus (Xr)（含或不含 P. amylolyticus (Pa)）建立的四物种生物膜 (SPMX)、三物种生物膜 (SMX) 群落的结构； (B) D5、D10 和 D15 时 SPMX 和 SMX 生物膜中各物种的定量（μm3，生物量体积）；使用 Kruskal-Wallis 检验检测 D5、D10 和 D15 时生长的 Pa 的生物量的统计差异；SPMX 处理中 P = .004 （FDR 调整）（n = 3）；SMX 处理中 P = .056 （FDR 调整）（n = 6）； (C) 柱状图显示了随着时间的推移（D5、D10 和 D15）在整个根上形成的三物种（SMX）生物膜的估计总细胞数，由 qPCR 确定，并按平均根长（毫米）归一化（n = 9）； Kruskal-Wallis 检验用于检测根部细胞总数随时间的变化： "ns "表示 "不显著（P >.05）"； (D) 接种 SMX（由 S.rhizophila、M. oxydans 和 X. retroflexus 组成的三物种联合体，不含 P.amylolyticus），培养 5、10 和 15 天（D5、D10 和 D15）的 7 天大拟南芥幼苗的生长表型（比例尺 = 1 厘米）； (E）箱线图显示接种SMX 共培物D5、D10 和 D15 时拟南芥幼苗的主根长度（厘米）（n = 9）； (F)箱线图显示接种SMX 共培物 D5、D10 和 D15时拟南芥幼苗的茎鲜重（毫克）（n = 9）； 每组数据基于三个独立实验的九个生物重复（n = 9）；统计意义表示基于 Wilcoxon 秩和检验（Wilcoxon test）的 SMX 处理植株与对照植株之间的差异。

图 6 根表面多物种生物膜群落的共定位和细胞聚集分析； (A) 三物种生物膜成员M. oxydans (Mo)、S. rhizophila (Sr)和 X. retroflexus (Xr)相对于 P. amylolyticus (Pa)在 D5、D10 和 D15 的共定位情况，以及放大的共聚焦图像中的相应观察结果（条 = 10 μm）；实线为生物重复的平均值，阴影区域为生物重复的 SEM，每个重复分析五次；插入的图像显示了在三个时间点通过三维共定位分析的代表性结果； (B) 根上形成的 SPMX 多物种生物膜中 Pa 的微尺度细胞聚集体随时间变化的情况通过在 202.83 × 202.83 μm，大于 10 μm3 的聚集体中将相邻像素点连接起来分析； 点的大小按聚集体平均体积缩放，每个点对应一个生物重复；每个时间点的数据来自三个生物重复； (C) 三维视图显示了根表面大于 10 μm3 的模拟 Pa 细胞聚集体，分别对应于三个时间点（D5、D10 和 D15）；聚集体的颜色是循环的，以 202.83 × 202.83 μm 的比例表示 Pa 形成的所有不同聚集体。