AM：3D打印通过电化学分子锁构建用于组织再生的梯度仿生支架
【研究背景】细胞外基质(ECM)成分的梯度变化，是生物学的普遍特征，在组织发育和生理学中发挥重要作用。然后梯度结构在制造层面有较大难度，现有的组织工程支架通常忽略了梯度结构对组织再生的调控作用。组织再生中亟需高效制备同时具有连续梯度结构、多尺度结构和优异生物相容性的支架来更好的仿生组织的ECM。
为此，EFL团队提出了电化学结合力学训练方法来构建梯度生物水凝胶支架的新方法。首次报道了一种多尺度各向异性与连续梯度结构的生物支架，这种电化学-力学训练的水凝胶支架（ETH）呈现出从5nm到2cm的多尺度各向异性梯度结构（图1）。所构建的明胶基水凝胶支架，强度为12.67 MPa，与纯明胶比，提升了937倍（13.5 kPa至12.67 MPa）。
此外，ETH支架通过实现连续力学性能和梯度结构仿生了肌肉肌腱连接处组织（MTJ），其在体外能够有效支持肌肉细胞和肌腱细胞重塑ECM微环境，并在8周内有效促进体内缺损肌腱组织的快速再生。总的来说，这项工作将纳米结构的精确制造与宏观结构的高效制造结合起来，为构建工程仿生组织支架提供了新的思路。
相关研究以“3D Printing of Gradient Biomimetic Scaffold via Electrochemical Molecular Lock for Tissue Regeneration”为题发表在《Advanced Materials》。浙江大学贺永教授、浙江省人民医院何晶特聘副研究员和浙江大学原禧敏助理研究员为论文共同通讯作者，共同第一作者为姚克博士、夏鹏程博士和孔维程博士。
图1 ETH支架设计思路示意图
研究者首先通过低温3D打印制造均匀的初始支架（图2A（i）），明胶中丰富的氨基可以通过静电相互与卡拉胶形成双网络结构。接下来，将定向循环拉伸和盐析处理结合（图2A（ii）），硫酸铵取代水分子的位置，在水凝胶支架的表面和内部形成定向微结构，构建离子迁移的高速轨道。最后，在定向电场强度下对支架进行了电化学训练（图2A（iii））。在此过程中，卡拉胶通过其硫酸基团在GelMA网络中充当功能化协调剂。铁离子通过先前制造的定向多尺度微通道快速迁移，建立了梯度分子锁，从而形成稳定的梯度结构并显著增强支架的机械性能。通过整合物理和化学训练技术，建立了稳定的互穿分子网络，从而增强了水凝胶支架的机械性能。此外，双网络水凝胶分子互穿中金属离子的配位共同促进了多尺度、仿生梯度结构的发展。
图2 ETH支架的制造工艺
进一步，研究者对ETH支架的电化学原理和性能进行详细表征。首先卡拉胶的引入显著提高了支架的导电性，在添加𝜅-卡拉胶后，两组支架的高频交流电阻分别下降了62.7%和35.5%，从而清楚地说明了𝜅-卡拉胶对改善支架电导率的影响。此外，由于定向结构的影响，机械训练显着提高了支架在低频区域承受电化学训练的能力（图S3，S6），从而为离子迁移和梯度结构的发展奠定了基础。XRD和DSC的结果进一步表明，ETH支架表现出有序性和结晶度的显著增加，验证了电化学训练对增加水凝胶支架取向度、结晶度和热稳定性的显著作用，从而增强了机械性能。
图3 ETH支架的电化学原理和表征
此外，我们研究了梯度脚手架构造的原理。图4A说明了水凝胶材料的构建方法，左上角的扫描电子显微镜图像显示了水凝胶的层状结构特征，表明其微观结构致密且高度定向。中心图展示了分子设计的示意图，突出显示 κ-卡拉胶和 GelMA 作为主要水凝胶网络框架的作用。Fe3+离子的掺入促进了通过非共价和配位相互作用形成多面网络，在该复合网络中，卡拉胶分子链上的硫酸基团与Fe3+离子形成稳定的配位键，而卡拉胶和GelMA之间发生氢键和静电相互作用，进一步增强了网络的稳定性和可调性。该图有效地说明了水凝胶中通过配位键连接不同分子链实现协同物理和化学交联的策略。
图4 ETH支架的梯度结构制造机制
不仅如此，研究者证实了ETH支架能够显著促进TSPCs和C2C12在体外重塑肌腱&肌肉ECM微环境的作用。C2C12细胞在ETH支架上表现出高度定向的生长结构。胶原蛋白和MHC蛋白的有效表达进一步表明ETH支架有效支持肌腱和肌肉细胞在体外重塑ECM微环境的作用。这种多组织界面的协同效应证明了这些支架在促进MTJ修复和再生方面的潜力（图5）。
图5 ETH支架有效支持TSPCs和C2C12的功能性表达及缺损MTJ的快速再生
最后，研究者将 ETH支架直接植入受损的MTJ组织中，以研究物理结构线索对组织再生和修复的影响。组织学检查（H&E）结果表明，术后4周，各组均可观察到一定量的组织，且试验组组织明显较大，说明ETH支架可以促进早期组织的快速再生。术后8周，ETH组组织已定向且与正常组织几乎一致，而对照组仍混乱。如图5F所示，8周后，植入ETH支架的组织表现出与正常组织基本一致的修复水平。相比之下，空白组和对照组的肌腱修复效果明显较差，这与Masson染色的结果一致。进一步通过机械测试，评估新生组织的力学特性（图5K）。与空白组（9.68 MPa）和对照组（13.06 MPa）相比，ETH组修复后的MTJ表现出显着更高的拉伸模量（24.89 MPa），这表明ETH支架能够有效促进MTJ的再生。
图6 ETH支架能有效促进兔MTJ的结构和功能再生
这项工作提出了一种新颖且简单的连续梯度支架的制备方法。解决了在体外同时再现多尺度各向异性和连续梯度结构的困难。ETH支架呈现出从5nm到2cm的多尺度各向异性结构，仿生肌肉肌腱连接处，并实现连续力学性能和梯度的构建。它在体外促进MTJ组织中ECM微环境的细胞重塑，并在八周内增强体内MTJ缺陷的加速再生。总的来说，这项研究将纳米结构的精确制造与高效的宏观结构制造结合起来，提出了一种构建生物级连续梯度水凝胶支架的新方法，为构建工程仿生组织支架提供了新的思路。
全文链接：
https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202513484
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