用于组织再生的GelMA强韧水凝胶

154 Tough Gelatin Hydrogel for Tissue Engineering.pdf

人体的软组织有很多力学性能优异的结构，如韧带等，然而人造的材料极难兼具天然韧带的生物相容性及强韧性。目前强韧水凝胶的研究有很多报道，其力学性能也能达到韧带等的要求，然而，由于强韧水凝胶的研究设计不是为组织再生服务的，由于其制造过程中易引入有毒试剂，材料组分生物相容性差、不可降解等原因，尚未见能成功用于组织再生的相关报道。

为解决强韧水凝胶无法用于组织工程这一困境，近日，EFL团队与南京市第一医院姚庆强教授及哈尔滨工业大学徐杰教授合作提出一种基于光固化明胶GelMA的强韧水凝胶(GBTH)，以用于组织再生修复。

材料的强度不高，其核心原因是受力后产生的裂纹迅速扩展所导致，受人类运动强化肌肉启发，我们利用协同效应产生高功能的晶体域来抵抗裂纹扩展。经过训练后的GelMA，其抗拉强度可达6.67 MPa (提升145倍)。此外，由于其优异的强韧性、生物相容性、体内自降解性以及与天然组织成分的相似性，能被直接缝合到成年兔子的断裂肌腱上。断裂的肌腱可以通过GBTH补偿机械转导，刺激肌腱分化，在8周内迅速恢复到初始状态。我们的策略为制备高生物相容性的坚韧水凝胶提供了一条新的思路。该研究以“Tough gelatin hydrogel for tissue engineering”为题发表在《Advanced Science》期刊。贺永教授、徐杰教授、姚庆强教授为通讯作者，原禧敏博士生、朱舟医生、夏鹏程博士生为共同一作。

【明胶基水凝胶强化训练思路】

肌肉训练过程是一个力反复给肌细胞刺激，从而提升肌纤维能力的过程。在此过程中伴随着肌纤维力量的增加，会产生大量的乳酸。乳酸积累会导致训练被迫中断，NBA运动员通常使用液氮快速冷却来缓解这一现象(图1a)。受这个过程启发，我们开发了一种简便的方法来获得高生物相容性、单组分和仿生结构的强韧水凝胶。(1)、将GelMA水凝胶置于盐溶液中进行机械训练(图1b)，水凝胶内部的分子链沿着轴向载荷的方向重新排列，结晶度增加。根据Hofmeister效应，预浓缩的水凝胶链在SO₄^2-的作用下强烈自聚集，从原来的均相中分离出来。水凝胶的相分离随着时间的推移而发展，直到产生足够结晶度。(2)、将训练好的水凝胶浸入PBS中，从而将SO42-从水凝胶中排出，并由水分子取代，从而确保生物相容性。(3)、不停重复这一过程，PBS处理可类比于人体运动后的液氮处理，经过多次盐溶液训练和PBS浸泡处理后，水凝胶内部链的结合作用变得更强(类似于人类自我训练增强肌纤维)。盐溶液训练过程中链的排列变得高度有序，结晶度提高，加强水凝胶分子链，提高其固有弹性。晶体域可以作为刚性的、高功能的交联剂，因此它们可以通过钉扎裂纹延缓单个分子链的破裂，使原始水凝胶变得强韧(图1c)。我们的策略可以使普通水凝胶的强度提高145倍，抗拉强度达到6.67 MPa。GBTH能够承受2公斤(其自身重量的1000倍)的重量，并且打结时不会断裂(图1d-e)。此外，GBTH可以被直接缝合于成年兔断裂的肌腱，并在8周内实现损伤肌腱快速恢复到初始状态，这主要是因为GBTH可以补偿肌腱的机械传导功能，激活肌腱分化(图1f)。

图 1. 强韧性水凝胶制备示意图。(a)人体肌肉强化示意图。(b)高生物相容性、强韧性水凝胶制备示意图。(c)水凝胶强化机理示意图。(d)强韧性水凝胶的力学性能。(e)用于举重的强韧性水凝胶。(f)体内植入修复肌腱示意图。

均质结构的形成

我们阐明了GBTH韧性机理(图2)。盐浓度和训练周期数被认为是两个主要参数(图2a-2b)。随着盐浓度的增加，水凝胶的力学性能得到改善(图2a，训练次数为20次);但当盐浓度超过50%时，水凝胶的力学性能开始恶化。宏观成像显示，水凝胶有不同程度的收缩，这是由于Hofmeister效应引起的分子链自发聚集。相应的SEM成像表明，低盐浓度容易削弱分子链的聚集，导致水凝胶内部的蜂窝孔孔径较大，均匀性差。当盐浓度接近50%时，水凝胶内部的蜂窝孔呈高度排列、孔径均匀的趋势;当浓度超过50%，分子链排列无序，导致水凝胶内部空间结构破坏，力学性能恶化。因此，最佳盐浓度为50%。

水凝胶在盐溶液中循环拉伸数次后，立即浸入PBS溶液中1 min，作为完整的机械训练。水凝胶的性能随训练次数的增加而增加; 然而，在循环20个周期后，性能开始下降(图2b)。宏观图像显示，当训练周期达到30次时，水凝胶严重变形，难以恢复。SEM图像显示，在10次训练循环时，水凝胶内部的蜂窝孔开始出现排列(与SAXS成像一致)，但孔径均匀性较差。训练次数进一步增加，水凝胶中的蜂窝孔趋于高度排列。SAXS图显示高结晶度(分子链排列有序度)，孔径均匀。此时，水凝胶的力学性能达到最佳值。然而，当训练次数超过20次时，水凝胶的均匀蜂窝结构被破坏。此外，通过XRD和DSC表征方法更准确地描述结晶度(图2c)。虽然经过20多次训练，结晶度提高，但当结晶度超过一定阈值时，材料的韧性变差，导致材料的机械质量下降。因此，高结晶度不应被视为主要目标。

除了晶体结构外，水凝胶聚合物链之间强烈的氢键相互作用也改善了水凝胶的力学性能。利用水凝胶中氢键的强度被认为是改善水凝胶力学性能的有效途径，其中氢键是水凝胶中的动态交联位点，为机械能量耗散提供了“牺牲域”。 FTIR用于表征水凝胶聚合物链之间的氢键相互作用(图2d)。在3,009 cm^-1处的宽带对应于CH₃的拉伸振动。随着训练周期从10次增加到20次，从3,008 cm^-1增加到3,005 cm^-1，表明氢键相互作用的强度逐渐增加(发生蓝移)。然而，从20到30个训练周期，从3,005 cm^-1下降到3,007 cm^-1，表明氢键相互作用的强度逐渐减弱(红移)。这一结果与水凝胶的力学性能一致，说明超过20次拉伸会降低水凝胶的力学质量。高含水量是水凝胶的重要特性，过多的训练周期或过高的盐浓度会导致水凝胶失水过多而降低质量(图2e)。因此，最佳实验参数为20个训练周期和50%的盐浓度，并以此为基础进行下面的讨论。

图 2. 明胶基坚韧水凝胶的力学性能。(a)盐浓度对水凝胶力学性能的影响。(b)水凝胶的机械特性与训练周期次数的关系。(c)水凝胶的结晶度与训练周期次数的关系。(d)水凝胶的FTIR表征。(e)不同处理的水凝胶含水量。插图显示了水凝胶相应的SAXS模式。比例尺:初始尺寸为100 μm，放大尺寸为20 μm。

强韧性分析

原位共聚焦激光扫描显微镜进一步解释了GBTH的高疲劳阈值机制(图3)。初始水凝胶是各向同性的，没有定向结构，孔径均匀性差。更重要的是，它们没有多功能性的晶体域来钉扎裂纹扩展(图3a)。缺口在预拉伸过程中有一个尖锐的锐角，无法钝化裂纹，说明这是一种典型的各向同性材料(图3b中红线表示尖锐的缺口形貌)。

与初始水凝胶相比，GBTH表现出明显的各向异性。训练引起水凝胶的各向异性，导致蜂窝结构的定向排列，减小孔径，增加其密度，从而增强水凝胶(图3c)。根据能量耗散机制，增加缺口断裂过程中的能量耗散速率，使水凝胶变得更坚韧，晶化过程中产生的晶域作为刚性、高性能的交联剂，使其能够钉扎裂纹，延缓裂纹扩展。在缺口预拉伸过程中，GBTH呈逐渐破坏形式，且未观察到垂直于拉伸方向的裂纹扩展。此外，缺口呈圆角钝角，表明水凝胶可以钝化裂缝(红线表示钝形缺口地形)。即使缺口接近100°也没有破坏水凝胶，表明GBTH具有很强的抗性(图3d)。

值得注意的是，由于诱导的各向异性，缺口水凝胶在平行于取向方向拉伸时表现出优异的力学性能:与初始缺口水凝胶相比，抗拉强度为667 kPa，断裂韧性为78.5 KJ/m²，分别提高了159倍和1189倍(图3e)。为了评估GBTH的抗疲劳裂纹扩展能力，进行了1000次50%变形循环(图3f)， GBTH保持了优异的力学性能，并表现出6.7 KJ/m2的高疲劳阈值(图3g)。综上所述，强化机制主要是由于氢键和晶域的形成导致结构密度的显著增加，而增韧机制主要是由于溶剂诱导水凝胶结构各向异性的形成、晶体域对裂纹的钝化以及能量耗散。在多尺度结构发育过程中，水凝胶的抗拉强度和断裂伸长率同时增加。

图 3. 强化的同时增强韧性。(a)初始水凝胶的增韧机理。(b)裂缝垂直于均匀蜂窝纵向的预拉伸缺口初始水凝胶。(c)明胶基坚韧水凝胶的增韧机理。(d)裂缝垂直于均匀蜂窝纵向的预拉伸缺口明胶基韧性水凝胶。(e)缺口水凝胶的应力-应变曲线。(f)缺口水凝胶的抗疲劳性能。(g)缺口水凝胶的能量释放率。标尺尺寸为100 μm。

抗疲劳强度

为了证实GBTH具有优异的类肌肉性能，进行了循环疲劳试验。经过类肌肉训练后，初始水凝胶的力学性能得到了质的改善，应变、应力和断裂能值分别提高了3.5倍、146倍和991倍(图4a)。此外，还对GBTH进行了轴向循环拉伸，以评估其抗疲劳性能和实际应用的适用性。由于存在可逆牺牲结构(主要是氢键)，水凝胶表现出一定的滞后性。即使在2万次轴向循环后，它仍保持与第一次循环后相似的状态，表明GBTH具有优异的抗疲劳性能(图4b)。随着循环次数的增加，曲线向下移动的原因可能有两种:一种可能是万能试验机的机制，另一种可能是由于长时间和大量的循环拉伸导致水凝胶产生一定的塑性变形。令人惊讶的是，即使经过2万次的疲劳和适当的训练，水凝胶的力学性能也有了明显的改善，这与之前的训练方法的结果一致，表明GBTH具有更好的自我强化能力(图4c)。这些结果表明，在实际应用中，疲劳并不是一个问题(尽管应变略有降低，但对于许多应用场景来说已经足够了)。

与目前常用的水凝胶强化方法(冷冻铸造、纳米纤维、机械拉伸、双网、复合、和交联水凝胶)相比，我们的处理方法具有优势。虽然我们的方法在增强水凝胶的应力应变方面不是最佳的，但它可以通过简单方便的策略制备具有单一组分，高度生物相容性和仿生结构的坚韧水凝胶(图4d-e)。

此外，从图片中可以直接观察到GBTH优异的力学性能(图4f)。通过我们的策略，它可以在水凝胶的初始状态上被拉伸几倍。此外，我们还比较了GBTH和PDMS(一种常见的有机硅凝胶)的力学性能。其力学性能超过PDMS，其变形强度和抗拉强度约为PDMS的两倍(图4g)。值得注意的是，我们的策略已经能够生产出一种坚韧的水凝胶膜，它可以承受尖锐的镊子垂直推力，这远远超过了最初的明胶基水凝胶的抵抗能力。

图 4. 明胶基坚韧水凝胶的性质。(a)明胶基韧性水凝胶的应力-应变曲线。插图为水凝胶初始状态下的应力-应变曲线。(b)明胶基坚韧水凝胶的抗疲劳性能。(c)明胶基坚韧水凝胶的自我增强特性。(d)明胶基坚韧水凝胶的抗拉强度和断裂伸长率的Ashby图像。(e)坚韧水凝胶与其他代表性的增强水凝胶的比较。(f)水凝胶的光学图像。(g)明胶基坚韧水凝胶与代表性硅基PDMS的力学性能比较。

功能补偿仿真

当肌肉收缩时，肌腱遵循往复运动，承受复杂多变的张力。因此，在损伤肌腱的治疗中，除了简单的细胞生长支架外，修复材料还必须具有可靠的弹性，维持组织的力传导，防止肌腱挛缩。考虑到它们的肌肉样特性，我们评估了训练韧水凝胶是否可以作为受伤肌腱的临时功能补偿。如图5a所示，坚韧水凝胶的功能代偿模拟依赖于自行开发的肌肉收缩模拟器，如前所述，在典型的分期培养中进行。与神经、血管等组织相比，肌肉组织具有更高的应激敏感阈值，需要足够的应激刺激才能激活其生理功能。因此，首先验证了初始水凝胶和训练后的水凝胶在模拟器上的操作可行性。如图5b所示，经过几次拉伸循环，拉伸率从0%到100%，训练后的水凝胶能够保持自身的结构完整性和长度稳定性。相比之下，初始水凝胶组仅承受约20%的拉伸变形，并且在进一步拉伸时发生断裂，因此难以对细胞施加足够的应力。因此，训练后的水凝胶组最终被纳入肌腱功能代偿模拟和激活阈值的研究。

为了检测不同程度肌肉收缩模拟下细胞的生存能力，进行了细胞形态学和增殖能力实验。虽然肌腱间充质干细胞(TPSCs)在0%-100%组中表现出良好的存活形态(图5c)，但其增殖在各组之间存在差异。在低血清环境下，不同程度循环模拟下的TPSCs均未表现出明显的增殖行为(图5d)，而在正常血清恢复后，无肌肉收缩模拟或收缩较少的0%组和20%组均有明显的增殖，特别是0%组，呈现典型的增殖曲线。相应的，从第4天到第10天，50%和100%实验组的细胞增殖速度较慢(图5d和5e)。这种趋势可能是由于50%组和100%组TPSC分化的差异，因为间充质干细胞分化为终末细胞的能力相应减弱甚至丧失。

通过对TPSCs机械感觉和反应的关键蛋白进行染色，探讨韧性水凝胶是否能够部分补偿肌腱的力传导功能，从而达到激活肌腱分化的阈值。定位于细胞膜上的整合素(Integrins, ITGs)是主要的应激受体。肌肉收缩模拟组4天后，细胞膜上的ITGβ有不同程度的激活(红色荧光)，其中100%组最明显(图5f中黄色箭头)。此外，如图5g所示，坚韧水凝胶的肌肉模拟也有效地增加了yes相关蛋白(YAP)的含量，这对细胞机械应力感知至关重要，而在50%和100%的处理中，观察到YAP有向细胞核移动的趋势(黄色箭头)。基因和蛋白表达水平进一步证实了上述结论，韧性水凝胶可以进行模拟肌肉后燃刺激，尤其是50%和100%组(图5h和5i)。因此，坚韧水凝胶作为一种生物友好型基质，可以补偿受损肌腱的应力功能，维持肌腱细胞的力学敏感性，为TPSCs等干细胞修复肌腱损伤提供基础(图5j)。

我们进一步评估了坚韧水凝胶在应激刺激下达到促进TPSCs肌腱分化的阈值的性能。第14天，如图5k、5l、5m和S7所示，无论是促进肌腱分化的tenomodulin (TNMD)和Homeobox protein Mohawk (Mkx)，还是主要为修复肌腱而产生的胶原(Col1)，其表达水平在50%组和100%组均最高，两者之间无显著差异。然而，虽然已经激活了应力相关蛋白的表达，但似乎20%的韧性水凝胶延伸率并不能有效促进TPSCs的肌腱分化。在这里，转录组分析被用来进一步确认坚韧水凝胶的变形量和诱导分化的阈值之间的关系。如图5n所示，随着模拟肌肉收缩的终止，所有组的TPSCs在第14天不再表现出明显的机械感应活性。然而，对肌腱修复有积极作用的基因，如tenascin家族、col1a和弹性蛋白(eln)在50%和100%组中高表达，而在20%组中高表达维持在正常水平。此外，基因本体(Gene Ontology, GO)的结果再次证实，施加50%或以上变形量的拉伸，可以促进粘附在坚韧水凝胶上的干细胞的分化过程，并促进其细胞外基质(胶原)的重建(图5o)，这是肌腱再生的核心要求。对于低于激活阈值的肌肉收缩模拟，20%组细胞的胶原生成活性明显低于50%和100%组(图5p)，证实它们没有进入有效的肌腱修复过程。同样，由于可恢复变形极限仅为20%左右，推测初始水凝胶不具备促进肌腱修复的有效机械传导能力。

图 5. (a)肌肉收缩模拟介绍，0%-100%表示拉伸与变形的比值。(b)初始水凝胶和经过训练的水凝胶在模拟器上的操作可行性。(c)扫描电镜下的细胞形态。(d-e) TPSC增殖行为。**P<0.01;***P <0.001. N = 3。(f) ITGβ(红色)、f -肌动蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光染色。(g) YAP(红色)、f -肌动蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光染色。(h) itgb1、yap、taz基因的表达。**P <0.01;***P <0.001. N = 3。(i) YAP蛋白表达水平。(j)韧水凝胶补偿肌腱的机械转导能力。(k) TNMD(红色)、f -肌动蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光染色。(l) mkx、tnmd、col1a1、col1a2基因的表达。*p = 0.033;**P<0.01;***P <0.001. N = 3。(m) COL1蛋白表达水平。(n)转录组分析的几个相关基因热图。(o) GO分析结果。(p)细胞成分富集结果。标尺均为30 μm。

肌腱损伤后重建

在确认其对传递的应力具有代偿作用后，采用韧性水凝胶修复家兔跟腱损伤。相应的，初始凝胶虽然不能完全作为应力传递载体，但可以作为细胞支架，因此初始水凝胶也被纳入体内研究。首先，坚韧水凝胶在体内被证明具有良好的生物安全性。GBTH在体内是可生物降解的，与未训练的水凝胶快速降解(14天)相比，GBTH具有明显更重要的抗消化能力(预计持续1 - 2个月)，可以为肌腱修复提供稳定的机械应力传导和细胞生长模板。然后如图6a所示，为了全面评估肌腱修复情况，我们建立了连续测试的兔肌腱损伤模型。首先用训练韧性水凝胶置换损伤肌腱，加载初始水凝胶置换损伤肌腱，同时保留切开的跟腱囊(图6b)。

肌腱组织微观结构的修复，特别是排列致密胶原纤维的重建，对于恢复至关重要。在修复早期(两周)，与对照组相比，在水凝胶治疗中，受损区域的胶原纤维数量增加，训练水凝胶组中有更多的规则纤维。两周后，虽然水凝胶修复组胶原蛋白数量增加，但形态不同，训练水凝胶组新形成的纤维呈直线排列(与正常肌腱胶原蛋白形态相似)，而初始水凝胶组新形成的纤维呈波浪形排列(图6c中蓝色箭头)。这种修复效果的差异持续到术后8周，坚韧水凝胶组训练后的组织形态与正常组织几乎没有病理差异(图6c和6d)。此外，受益于这种具有韧性的水凝胶的肌肉样生理修复，新肌腱的强度比其他组的新组织强2 - 4倍(图6e)。有趣的是，尽管初始水凝胶在四周时已经显示出胶原蛋白再生，但其功能似乎还没有足够成熟，无法提供比未处理肌腱更好的机械强度(图6c和6e)。进一步检测基因表达水平证实了上述趋势(图6f)，训练组组织中肌腱阳性的mkx、tnmd、col1a1基因上调。同时，在所有水凝胶组中，一些基质金属蛋白酶的表达水平都有所降低，这对细胞外基质胶原具有破坏作用，因此即使初始水凝胶在8周时也显示出一定的修复能力(图6c-6f)。

为了进一步评估坚韧水凝胶对损伤肌腱的有益作用，我们检测了新形成的胶原纤维。肌腱重建可产生I型胶原(COL1)和III型胶原(COL3)，其中COL1具有较好的功能恢复效果。如图6g所示，在天狼星红染色的极化观察图像中，训练组的胶原染色最为明显。然后，对胶原蛋白生成的连续监测定量显示训练组、初始组和自然组之间的差异(图6h)。在肌腱恢复的初始阶段(0-4周)，水凝胶加载组和对照组的COL1和COL3增加，纤维的数量(而不是结构)在两组之间没有差异。在后期，韧性水凝胶的优势更加明显，COL1和COL3的再生速度明显快于其他组。更重要的是，在4周后的修复过程中，训练组COL1水平比COL3水平上升更快(COL1/COL3比值增加)，这对肌腱的生理愈合至关重要。此外，COL1和COL3的特异性免疫荧光染色图像也证实了上述趋势(图6i)。如图6k所示，基于胶原定量的修复效率也显示了韧性水凝胶治疗损伤肌腱的时间特征。具体来说，由于水凝胶的支架功能，在损伤肌腱的早期修复效率更高。然后，由于优异的力学性能和机械导电性，坚韧的水凝胶能够弥补肌腱功能的缺失，有效地刺激干细胞分化。在第四周的YAP和TNMD免疫荧光染色结果中也显示了这种积极作用(图6j和6l)。

由此可以推测，使用韧性水凝胶治疗肌腱损伤可能分为多个阶段(图6m)。在第一阶段，水凝胶连接断裂肌腱的两端，从而为迁移修复干细胞提供重要的生长基质和模板。因此，训练和最初的水凝胶在术后早期(2周)提供了显着的恢复促进。但随着肌肉收缩周期的增加，初始水凝胶逐渐变形断裂，无法支撑肌腱的功能;而我们制备的坚韧水凝胶由于其类似肌肉的特性，仍然保持可靠的弹性，并继续作为机械递质持续激活肌腱分化(在4周)。因此，在最终结果(8周)的比较中，GBTH水凝胶修复的肌腱胶原在胶原密度、比例和形态上都显示出最接近健康组织的多重优势。优异的机械性能和适当的肌肉拟态的协同辅助证实了坚韧水凝胶在肌腱修复应用中的优势。

图6. (a)体内肌腱修复实验介绍(b)术中图像。(c)第4周和第8周肌腱组织H&E和Masson染色。蓝色箭头表示弯曲的纤维，黄色箭头表示密集排列的纤维，n = 3。(d) H&E和Masson染色病理评分。*P <0.05; **P<0.01; ***P<0.001. N = 3。(e) 4周和8周时修复肌腱的抗拉强度。(f) 8周时肌腱组织中col1a1、tnmd、mkx、mmp3、mmp13基因的表达情况。* p = 0.0107;**P <0.01; *** P<0.001. N = 3。(g-h)天狼星红染色偏振观察结果及统计。*p = 0.0313; **P<0.01; ***P<0.001. N = 3。(i)肌腱COL3(红色)、COL1(绿色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光染色。(j) YAP(绿色)、TNMD(红色)和细胞核(蓝色)的肌腱免疫荧光染色。(k)训练和初始水凝胶的愈合效率(与NC相比)。*P<0.05, n = 3。(l) YAP和TNMD肌腱免疫荧光染色统计。*P<0.05; ** P<0.001. N = 9。(m)肌腱重建的不同阶段。标尺均为200 μm。

小结

综上所述，通过盐溶液辅助拉伸成功制备了GelMA基强韧水凝胶，其强度为6.67 MPa，是初始水凝胶的145倍。此外，由于其具有优异的强韧性和生物相容性，在体内可自我降解，与天然组织成分相似，可以直接缝合到成年兔断裂肌腱上，通过补偿机械传导刺激肌腱分化，并在8周内迅速恢复到初始状态。为组织工程和再生医学中韧性水凝胶的制备提供了新的思路。

论文链接：http://doi.org/10.1002/advs.202301665